狂犬病作为一种烈性人兽共患传染病,每年导致至少60,000人死亡。近年来,虽然针对狂犬病及其病原狂犬病病毒的研究取得了很大进展,但高致病性狂犬病病毒的致病机制仍然有待进一步的研究,而透彻了解狂犬病病毒致病机制是探索狂犬病治疗方案、了解狂犬病流行特征、净化狂犬病的前提条件。包括本课题组以往工作在内的多项研究结果表明,外源免疫因子的插入、病毒基因组的重排等均能够影响病毒的生物学特性,然而这些研究并没有阐明强弱毒株之间生物学特性的差异。鉴于基因替换被广泛用来研究具有不同毒力病毒之间的差异,为了研究野生强毒株GD-SH-01的病毒基因在强毒株各生物学特性中所发挥的作用,本课题组以弱毒株HEP-Flury为骨架,分别将野毒株GD-SH-01的五个结构基因替换至HEP-Flury骨架上,获得了携带野毒基因的重组病毒rHEP-shN、rHEP-shP、rHEP-shM、rHEP-shG和rHEP-shL。先前的研究发现野毒株的N和L基因能够显著影响病毒的增殖,G和M基因是病毒发挥致病作用的重要基因,替换P基因毒力显著减弱,然而背后的机制并不清楚。本研究设计进一步的实验,拟分析其可能的机制。在HEP-Flury的骨架上,替换野毒株的N基因后,细胞内病毒基因组RNA显著增多;而替换野毒株的L基因后,病毒的细胞间扩散能力显著增强;虽然两者策略不同,但都能够使病毒的体外增殖能力增强。替换野毒株的G基因后,小鼠脑内的获得性免疫相关分子没有显著上调,同时外周血中中和抗体(VNA)也未能达到保护水平(小于0.5IU/mL),而病毒载量和炎症相关因子显著增多,并且感染小鼠死亡率显著提高。我们可推测,GD-SH-01 G基因通过帮助逃逸宿主适应性免疫应答,导致了rHEP-shG对小鼠致病性增强。而在2FFU/只的小剂量感染情况下,rHEP-shM的乳鼠颅内感染致死率亦显著高于HEP-Flury,提示M基因可能影响病毒的体内增殖能力,提高病毒毒力。通过分析感染rHEP-shP小鼠脑内的免疫因子表达水平,我们发现rHEP-shP感染组的适应性免疫分子显著高于HEP-Flury组,同时外周血中的VNA水平也显著高于HEP-Flury组,这可能在一定程度上解释了rHEP-shP的致弱机制。同时我们发现感染野毒株的小鼠在濒死前外周血中存在高水平的VNA,然而小鼠也并未因此存活,尽管我们课题组另外的研究表明滴鼻感染野毒株在感染后期能够打开血脑屏障,然而此时入脑的VNA不足以清除脑内已经大量复制的病毒,从而无法避免致死性的结果。通过研究重组病毒在体外的一步与多步生长曲线,结合嗜神经指数,我们发现:与HEP-Flury相比,野毒株GD-SH-01具有更高的嗜神经性。本课题组先前另一研究表明,相比HEP-Flury,GD-SH-01能够刺激NA细胞产生更显著的凋亡。这与一些野生型病毒不引起凋亡研究相异,因此,我们进一步对这一现象进行了验证,并探究其作用机制。流式细胞术的检测结果表明,除了M和G基因,P基因在GD-SH-01致凋亡过程中也发挥了重要的作用。与HEP-Flury相比,重组病毒rHEP-shP能刺激产生更显著的凋亡。信号通路研究发现,该凋亡主要因为内源性凋亡通路被激活:rHEP-shP感染抑制了促凋亡蛋白Bax的表达,下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,从而使线粒体膜电位降低,线粒体内的细胞色素c释放进入细胞质,细胞色素c连同Apaf-1与pro-Caspase-9形成复合体并同时激活Caspase-9,激活的Caspase-9进一步激活了Caspase-3,后者剪切底物PRAP,最终导致细胞凋亡的发生。为了更深入地分析GD-SH-01和HEP-Flury致病性的差异,及野生型强毒株GD-SH-01 G基因及M基因的功能机制。我们以亲本株GD-SH-01和HEP-Flury,以及重组病毒rHEP-shM和rHEP-shG感染Balb/c小鼠,取不同病毒感染组的鼠脑进行了比较转录组测序,通过分析不同感染组之间的基因表达异同,我们发现狂犬病病毒感染引起宿主基因的广泛上调,以应答病原入侵。通过利用短时间序列趋势分析(STEM),我们筛选得到一群各株病毒感染组呈现相同的表达趋势的基因,然后对该基因集群进行功能富集以及聚类分析,有针对性地分析与机体免疫反应相关的GO条目(term)。在这些GOterm下,与HEP-Flury感染组相比,筛选并鉴定分别在GD-SH-01、rHEP-shM和rHEP-shG感染组内显著上下调的差异表达基因,以筛选在宿主抗病毒感染的应答过程中可能发挥与相应重组病毒基因相关的重要生物学功能的差异基因。通过分析,我们发现4个病毒感染组拥有两个共同的显著性趋势(profile 6和profile8),但仅profile 8涉及的通路与预期通路相符。通过对profile 8进行GO功能富集分析,我们发现富集到生物过程的term分别为:rHEP-shM组113条,rHEP-shG组88条,GD-SH-01组112条,HEP-Flury组107条。并且发现大多数term与机体的抗病毒免疫相关,针对这个趋势进行进一步地深入分析。通过做4个病毒感染组的维恩图,找到共同拥有的基因集A以及GD-SH-01 M和G分别发挥功能的基因集B和C。一共筛选得到在不同病毒感染组差异表达的36个候选基因,并且通过RT-qPCR进行了验证。这些差异基因的筛选及鉴定,将为后续更有针对性地探究致病性狂犬病病毒的分子致病机制提供宝贵的线索及数据基础。本课题中,我们进一步研究了野生致病性狂犬病病毒GD-SH-01的各个病毒基因在重组病毒生物学特性中的功能,我们首次发现并证明了P基因在狂犬病病毒致凋亡中的重要作用。同时应用转录组学研究,对强弱毒株生物学特性差异的宿主应答基因进行高通量分析。本文的研究丰富了我们对野生致病性狂犬病病毒株的认识,为研究狂犬病病毒致病性及免疫原性的机制研究提供了新的思路及全面的宿主转录组信息。