听力残损是一个全球性的医学问题。目前,占人类10%以上的成年人群都患有不同程度的感音神经性耳聋(sensorineural hearing loss,SHNL),而听力下降随着年龄的老化而日渐增多。像中国这样一个发展中的大国,老龄化人群所占比例会进一步上升,耳聋占人类群体的比例也会进一步升高。我国听力言语残疾者约有2700万人,新生儿听力障碍的发病率达1/1000。听力残损不仅给患者生理、心理及家庭带来痛苦,而且对社会经济的发展也造成了严重的影响。研究发现,许多感音神经性聋与免疫因素有关,但在临床工作中常不被重视。突发性耳聋(sudden deafness,SD)、梅尼埃病、耳硬化症、慢性中耳炎、颞骨创伤及一些伴发听力丧失的全身免疫性疾病都存在内耳免疫因素。目前,免疫相关性内耳疾病的名称有多种,自身免疫性内耳疾病(autoimmune inner ear disease, AIED)是其暂定统称。近十几年来,该病在世界范围内被报道越来越多,我国也有陆续报道,但因其流行病学特点不清,发病机制亦不明确,故其临床诊断还十分困难。AIED主要症状:进行性、波动性、双耳或单耳的感音神经性聋,可伴耳鸣、眩晕(除外噪音性聋,药物性聋、外伤性聋、早老性老年性聋等),血清免疫球蛋白IgG、IgM、补体C3、循环免疫复合物等免疫学参数变化。国内外先后报道,在AIED患者中检测出了不同的非内耳组织特异性抗原:热休克蛋白70、Raf-1蛋白、Po蛋白、β-肌动蛋白、β-微管蛋白、68KD蛋白、钙粘蛋白S-100β、Ⅱ型胶原、层粘连蛋白等。由于发病机制不清,既没有确定免疫系统攻击的内耳特异性抗原,又没有特异性实验检查指标,故AIED在治疗原则上还存在争议。至今尚未发现有研究报道证明热休克蛋白70(heat-shock protein 70,Hsp70)的产生是自身免疫性内耳疾病的主要因素,还是一种从属的关联因素以及Hsp70是怎样发挥作用造成内耳损伤而引发AIED的。研究证实,Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)介导Hsp70的信号传导,诱导hsp70活化NF-кB,启动相关靶基因转录,表达炎性细胞因子及细胞黏附分子(TNF-α,ICAM-1等),介导炎性反应。本课题就此通过建立一种高阳性率的伴听力损害的自身免疫性内耳疾病的动物模型,探讨TLR4、Hsp70、及其信号传导阻断剂TLR4抗体与实验性自身免疫性内耳病的关系,阐明TLR4/Hsp70在病因学上的地位和重要性,并进一步探讨其可能的发病机制,同时也为研制受体阻断剂,开发与TLR4有相同靶点的新的抗炎药物提供理论依据,为AIED的预防和临床治疗提供新的治疗策略。第一部分自身免疫性内耳病动物模型的建立目的:拟建一种高阳性率听力损害的自身免疫性内耳病动物模型,并证实模型建立成功。方法:提取豚鼠内耳膜迷路组织,采用制备性SDS-PAGE从内耳组织中分离、纯化Hsp70蛋白,豚鼠经过环鳞酰胺预处理后,以纯化的豚鼠内耳Hsp70作为抗原与等量弗氏完全佐剂进行颈、背部、足部皮内多点注射接种免疫豚鼠,观察内耳形态变化;检测血清抗Hsp70抗体;测定不同时段听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)阈值、血清免疫球蛋白IgG、IgM、C3及循环免疫复合物(circle immune complex,CIC)浓度,并观察内耳损伤程度。结果:动物免疫后7d,ABR阈值最大程度升高,听功能下降;血清IgG、C3、CIC明显升高,这与临床上AIED患者血清学检查结果一致。在患自身免疫性内耳疾病时,组织损伤大多是由Ⅱ、Ⅲ型变态反应引起,可以出现血清IgG、IgM和C3、CIC的升高;血清中检测到抗hsp70抗体;内耳出现炎细胞浸润,螺旋神经节细胞变性、脱髓鞘改变;免疫后14d与免疫后7d结果无明显变化;免疫28d后,上述各值开始降低,听功能开始好转。结论:纯化的同种异体hsp70抗原免疫豚鼠后能够提高ABR阈值,降低听功能,增加血清IgG、IgM、C3、CIC浓度,表明自身免疫性内耳病动物模型建立成功,其中以动物免疫后7d模型建立最为理想。第二部分TLR4介导的Hsp70信号传导与ABR的关系目的:在自身免疫性内耳病动物模型中检测不同时段模型动物内耳TLR4、Hsp70及其诱导产生的NF-κв(P65)、TNF-α、ICAM-1表达与ABR的关系,证实ABR值提高与Hsp70、NF-κв(P65)、TNF-α、ICAM-1表达增加正相关,表明TLR4介导的hsp70信号传导与自身免疫性内耳病的疾病发展过程正相关。方法:从第一部分已知,豚鼠接种免疫后7d内耳形态学和病理改变最明显、28d后开始恢复正常。故选取第一部分接种免疫后7d, 28d的模型动物,断头处死(处死前行ABR检测),提取耳蜗,制作石蜡切片;提取内耳总蛋白;采用免疫组织化学、原位杂交、western blot、ELASA等方法检测上述指标在内耳的表达,运用直线相关方程分析ABR与TLR4/Hsp70的相关性。结果:豚鼠免疫后7d,ABR值最大程度升高,为51.25±3.48dB,听功能下降最低,内耳TLR4、Hsp70、NF-κв(P65)、TNF-α、ICAM-1的表达明显增加,免疫后28d,ABR值降低,为48.75±3.54 dB,豚鼠听功能开始提高,上述各指标的表达也开始下降,ABR与TLR4/Hsp70直线相关分析呈正相关。说明内耳在同种异体外来抗原的刺激下,发生免疫应答,使内耳Hsp70的表达增多;TLR4识别增多的hsp70信号,并介导其信号传导,活化Hsp70,诱导其激活NF-κв(P65),调控和释放炎症因子和炎症介质,引发内耳损伤,听功能亦随之下降。结论:在自身免疫性内耳病动物模型中,ABR值与TLR4、Hsp70、NF-κв(P65)、TNF-α、ICAM-1表达均增加,且ABR值随TLR4/Hsp70表达的增加而升高,直线相关分析证明两者呈正相关。表明TLR4/Hsp70与AIED的疾病发展过程正相关。第三部分鼓室注射TLR4抗体干预Hsp70在内耳表达的作用的研究第一节鼓室注射不同剂量TLR4抗体干预Hsp70在内耳的动态表达变化目的:鼓室注射不同剂量TLR4抗体,研究抗体注射时间和注射剂量对内耳Hsp70的表达,选择最佳注射时间和抗体注射剂量。方法:豚鼠免疫后2d、5d、7d,每只耳分别经鼓室注射TLR4抗体50、100、150、200、250μg,采用免疫组织化学、原位杂交、western blot等方法观察不同时间不同剂量TLR4抗体对Hsp70在内耳的表达变化,从而选择最佳抗体注射时间和最佳抗体注射剂量。结果:豚鼠免疫后2d,注射50、100、150、200、250μg TLR4抗体,7d后内耳Hsp70的表达逐渐降低,而200μg与250μg剂量使Hsp70表达变化不明显;豚鼠免疫后5d、7d ,鼓室注射TLR4抗体干预hsp70表达的能力逐渐降低,但均发现200μg剂量TLR4抗体能最大程度干预Hsp70在内耳的表达,故选择豚鼠免疫后2d ,鼓室注射TLR4抗体200μg为最佳抗体注射时间和最佳抗体注射剂量。结论:在豚鼠免疫后2d,每只耳经鼓室注射TLR4抗体200μg,可最大程度干预Hsp70在内耳的表达。第二节TLR4抗体干预后NF-κв(P65)、TNF-α、ICAM-1、在内耳的表达变化及意义目的:观察鼓室注射TLR4抗体后内耳NF-κв(P65)、TNF-α、ICAM-1的表达变化,并进一步探讨其可能的病因学机制。方法:将动物随机分为实验组、干预组和对照组,联合早期实验结果,模型动物免疫后2d,干预组施加干预因素:每只耳经鼓室注射TLR4抗体200μg,7d后,每组动物行ABR检测,然后处死动物,采用免疫组织化学、原位杂交、western blot、ELISA等方法检测各组动物内耳ICAM-1、NF-κв(P65)、TNF-α的表达。结果:动物免疫后7d ,豚鼠ABR明显升高,内耳ICAM-1、NF-κв(P65)、TNF-α呈高表达;给予TLR4抗体干预后,内耳NF-κв(P65)、TNF-α、ICAM-1表达明显降低,豚鼠ABR阈值降低,听功能提高。推测鼓室注射TLR4抗体后,与TLR4发生抗原抗体结合反应,阻断了TLR4介导的Hsp70信号传导通路,使Hsp70活性下降和诱导NF-κв(P65)活化转录的功能减弱,从而使NF-κв(P65)调控、诱导产生的炎症因子和炎症介质减少,内耳损伤减轻。结论:鼓室注射TLR4抗体,能抑制Hsp70基因mRNA和蛋白在内耳的表达,提高听功能;减少炎症因子和炎症介质的释放,减轻内耳炎症反应。提示TLR4/Hsp70在AIED发病中可能起主要作用,它可能是AIED发病的主要机制之一,并为进一步研发受体阻断剂,从而在源头控制炎症反应提供理论依据,为AIED治疗提供一种新的策略。