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目前,微生物单一砷代谢机制研究较为深入,但在一些微生物的砷代谢基因簇中,同时含有多个砷操纵子,例如,同时含有细胞质 As(V)还原和呼吸性As(V)还原操纵子(Shewanella sp. strain ANA-3),As(III)氧化与呼吸性As(V)还原操纵子(Herminiimonas arsenicoxydans)等。然而,对于同一微生物,不同砷操纵子中砷代谢基因之间的表达调控关系、以及如何协调对砷进行转化或代谢的分子机制研究甚少。这种同一微生物不同砷代谢机制之间的调控关系是目前微生物砷代谢机制研究的一个热点和难点问题,阐明多操纵子基因的表达调控以及对环境砷的响应关系,对于深入理解微生物在砷的地球化学循环的重要作用、以及砷污染环境的微生物修复都具有重要意义。 不产氧光合细菌(Anoxygenic phototrophic bacteria,APB) Rhodopseudomonas palustris CGA009基因背景清楚,拥有细胞质As(V)还原和As(III)甲基化的相关基因,其分布在3个砷操纵子上,有4个调控蛋白基因(arsR),可以作为研究多砷操纵子基因之间砷代谢基因表达调控的良好模型。本文以CGA009菌株为研究对象,首次从转录水平上探究了多个砷操纵子基因在不同砷环境条件下表达情况,阐明了砷与CGA009菌株3个操纵子基因的表达关系。在此基础上,克隆表达并获得了该菌株中的4个砷代谢调控蛋白(ArsR),并探究了ArsR与其中1个ars operon操纵区相互作用,以揭示CGA009菌株的3个ars operon在不同条件下表达调控的原因。还获得1株对砷具有高吸附特性的砷代谢调控蛋白重组菌株,研究了其对砷的吸附特性。主要结果如下: 采用分光光度法和real-time PCR方法,研究了砷对该菌株生长影响以及3个 ars operon基因的表达情况。结果表明:光照厌氧条件下,As(V)和As(III)对CGA009菌株生长抑制的半数效应浓度(EC50)分别为2.44 mmol/L和1.55 mmol/L,表明该菌株对砷具有良好的抗性。在As(III)和As(V)诱导下,ars2和ars3 operon基因能表达,但ars1 operon基因不表达。随着As(III)浓度的升高,ars2和ars3 operon基因表达量也随之升高。在低浓度(<1×10-6 mol/L)As(III)时即可诱导ars2 operon表达,继续升高As(III)浓度,能诱导ars2和ars3 operon同时表达,但ars2 ope ron的表达量更高,当升高至1×10-3 mol/L As(III)时,二者表达量无明显差别。As(V)存在时,ars2 operon和ars3 operon均在对数前期表达量最高,随着细菌生长,生物量升高,这2个operon砷代谢基因的表达量逐渐降低。因此,从转录水平可知,环境中As(III)浓度较低时,该菌株可通过细胞质 As(V)还原和As(III)外排的机制代谢砷,高浓度 As(III)时,除了 As(V)还原和As(III)外排外,还应同时具有As(III)甲基化作用。 构建CGA009菌株4个arsR基因表达载体,将其转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3)表达,Ni-NTA纯化,得到这4个 ArsR蛋白。通过凝胶滞缓试验(EMSA)检测这4个ArsR蛋白与ars1和ars2 operon的操纵区序列pars1和pars2的相互作用关系,结果显示4个蛋白都能分别与pars1和pars2作用,说明CGA009菌株的4个ArsR蛋白能参与调控ars1和ars2 operon的表达。50 mmol/L As(III)能够使这4个ArsR蛋白与pars1的复合物解离,表明ars1 operon的表达可能受高浓度As(III)诱导,但有待进一步验证。 4个arsR基因的重组E.coli菌株对3.0 mmol/L As(III)的抗性能力测定,其中 E.coli(ArsR2)的抗性最高。采用原子荧光光谱法探究 E.coli(ArsR2)对砷吸附特征,结果显示:与对照菌株相比,E.coli(ArsR2)对As(III)和As(V)的吸附能力分别提高了3.8倍和2.6倍,说明E.coli(ArsR2)对As(III)和As(V)具有较好吸附作用。该重组菌株对As(III)和As(V)的吸附的热力学过程均符合Langmuir模型。约50 min时E.coli(ArsR2)对As(III)吸附达到吸附平衡,吸附动力学过程符合伪一级动力学模型。pH7时,E.coli(ArsR2)对As(III)吸附量最大,pH8时对As(V)吸附量最大。在0-15.0 g/L Na+范围内,E.coli(ArsR2)对As(III)的吸附量没有表现明显变化,说明菌株对As(III)的吸附不受离子强度的影响。生物量为12.0 g/L(dry weight)时,该重组菌株对水中10μg/L As(III)去除率达到82.2%。该重组菌株能够选择性吸附As(III),对镉、铜、铅和锌4种金属离子无明显吸附。