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卵巢癌是严重威胁妇女生命和健康的恶性肿瘤。近30年来卵巢癌患者的5年生存率一直徘徊于30%-50%之间,化疗对其总体生存率并无明显改善,这其中的主要原因是由于卵巢癌细胞对化疗产生了耐受性。拓扑异构酶是调节DNA空间构型动态变化的关键性核内酶,其在卵巢组织中的表达与卵巢癌多药耐药及生存预后存在相关性,但是具体机制有待进一步的研究。因此,本课题首先探讨了拓扑异构酶各亚型的表达与卵巢恶性肿瘤预后及耐药的关系,然后通过构建RNA表达载体对其进行生物学行为研究,以期获得拓扑异构酶与卵巢癌多药耐药相关性的直接证据。拓扑异构酶各亚型在卵巢组织中的表达及与临床病理和预后的关系目的:研究拓扑异构酶与卵巢癌预后及耐药的关系。材料和方法:应用RT-PCR方法检测47例卵巢癌,20例良性卵巢肿瘤,20例正常卵巢组织中TopoⅡα,TopoⅡβ和TopoⅠmRNA的表达情况,进行阳性率及半定量的比较,将结果与临床病理资料进行统计学分析,并进行单因素生存分析及Cox回归模型分析。结果:TopoⅡα在卵巢恶性组织及复发卵巢癌患者中高表达;TopoⅡβ在卵巢恶性组织中高表达,并且与患者是否存在远处转移存在相关性;经多因素生存回归分析显示,TopoⅡα还可作为卵巢恶性肿瘤预后的独立因素。结论:拓扑异构酶与卵巢癌预后及耐药密切相关,可作为判断卵巢癌预后和耐药的参考指标。拓扑异构酶RNA表达载体的构建目的:构建TopoⅡαRNA表达载体。材料和方法:采用化学合成法合成了4对siRNA,通过RT-PCR检测其对TopoⅡα的沉默效果,从中筛选出一对沉默效果最好的siRNA,并根据质粒psilencer4.1插入片段的设计要求,合成双链DNA,并同时合成一对无关序列作为阴性对照。经退火,质粒双酶切,连接,转化,筛选阳性克隆,并经测序鉴定,测序成功后经Lipofectamine2000介导转染至高表达TopoⅡα的卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3/DDP,经细胞毒性实验筛选出表达重组质粒的细胞株。结果:成功构建了分别表达psilencer4.1-TopoⅡα,psilencer4.1-阴性对照,空psilencer4.1质粒的三种细胞株。结论:RNA表达载体的成功构建为进一步的基因功能研究奠定了基础。RNA干扰卵巢癌TopoⅡα表达逆转其耐药的体外实验目的:研究拓扑异构酶Ⅱα与卵巢癌耐药的关系及相关机制。材料和方法:分别采用瞬时转染和稳定转染进行RNA干扰实验。通过RT-PCR及WesternBlot检测siRNA对目的基因TopoⅡα的沉默效果,通过法,胞内药物浓度的检测,流式细胞仪检测细胞DNA周期检测转染前后耐药改变情况及可能的耐药机制。结果:瞬时和稳定RNA干扰都能有效的抑制目的基因的表达,转染后SKOV3/DDP耐药指数及胞内药物浓度降低,细胞G0-M期含量增加,S期含量减少。结论:从体外实验的角度获得了DNA拓扑异构酶与卵巢上皮癌多药耐药相关性直接证据。印证临床观察的结果,即DNA拓扑异构酶在肿瘤细胞的多药耐药中发挥重要的作用。