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背景与目的:胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一，在全球范围，发病率居恶性肿瘤的第4位，病死率居恶性肿瘤的第2位。长期以来包括手术切除及其他综合性治疗的应用，并没有带来满意的生存率。随着分子遗传学和分子生物学的发展及基因工程技术的进步，基因治疗已成为继手术、化疗、放疗之后的又一新的肿瘤治疗手段。胃癌的基因治疗在基础研究方面已取得了很大的进展，并显现出良好的临床应用前景。然而，临床实验提示单基因治疗恶性肿瘤效果有限，主要原因在于肿瘤的发生是复杂的多因素、多步骤、涉及多基因事件发生的过程，针对单一环节的转基因治疗常常不能达到满意的治疗效果。因此，向肿瘤细胞导入多种相关基因以形成叠加杀伤肿瘤细胞的效应，提高抗肿瘤效果是基因治疗的发展方向。随着分子生物学及相关学科的进展，药物敏感基因疗法（即自杀基因疗法）显示了较好的应用前景，目前研究最深入且应用最广泛的是编码胸苷激酶的TK基因及编码胞嘧啶脱氨酶的CD基因。其中单纯疱疹病毒胸腺激酶(HSV-TK)基因/苷昔洛韦(GCV)系统与大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(Ec-CD)基因/5-氟胞嘧啶(5-FC)系统是目前研究最深入、应用最早、最广泛的自杀基因系统。单自杀基因治疗过程中，单自杀基因系统治疗存在着对肿瘤细胞类型的依赖性，且易引起肿瘤耐药性等不足。所谓联合基因就是利用基因工程技术将两种或多种自杀基因连接在一起，或将自杀基因与免疫基因联合应用。目前应用最广泛为CD-TK基因，兼具两种前药转化酶活性，使两类自杀基因产物协同作用，突破了对肿瘤细胞类型的依赖性，尽可能地消除了瘤细胞对药物的耐药性，而且尚可扩大肿瘤治疗谱，从而提高该疗法的实用性。恶性肿瘤的发生、发展及预后与细胞端粒酶的异常表达有密切关系。肿瘤端粒逆转录酶（hTERT）高表达，能够刺激细胞分化，抑制凋亡发生，最终导致细胞永生化。通过封闭或下调细胞hTERT表达，可致端粒缩短，影响染色体稳定性，表现为细胞生长受抑制和促进细胞凋亡，肿瘤恶性表型发生逆转。RNA干扰(RNAi)是在mRNA水平上的基因阻断技术，可高效、特异抑制靶基因表达。临床资料显示:hTERT基因在胃癌组织的表达阳性率约为76％～86％。靶向hTERT基因的RNA干扰可有效下调hTERT在mRNA和蛋白水平表达，细胞增殖被抑制。因此，本课题通过构建表达融合自杀基因yCDglyTK及hTERT-shRNA的联合基因表达载体，通过体外实验研究其抗胃癌作用，探讨联合应用自杀基因治疗与抗端粒逆转录酶基因疗法治疗胃癌的可行性及调控细胞凋亡的机制。
方法:
(1)选择有效靶序列并构建靶向hTERT的干扰质粒pYr1.1-hTERT-shRNA;采用PCR法从pYr1.1-hTERT-shRNA中扩增shRNA表达框架，亚克隆至融合自杀基因载体pcDNA3.1(-)CV-yCDglyTK，构建联合基因质粒pcDNA3.1(-)-hTERT-shRNA/yCDglyTK;酶切、测序等鉴定重组质粒;
(2)以磷酸钙纳米颗粒(CPNPs)为载体，介导空白质粒、靶向hTERT的干扰质粒、融合自杀基因质粒及联合基因质粒分别转染SGC7901细胞，G418筛选，建立稳定转染的细胞株，免疫荧光、Real Time-PCR及Western-blot检测目的基因表达;
(3)MTT法检测联合基因/5-FC治疗体系对胃癌SGC7901细胞的杀伤作用;平板克隆形成实验检测联合基因/5-FC治疗体系对胃癌细胞克隆形成率的影响;
(4)流式细胞仪检测细胞凋亡;Western-blot检测联合基因/5-FC治疗体系对胃癌SGC7901细胞凋亡蛋白Bcl-2及Bax蛋白表达的影响。
结果:
(1)成功构建靶向hTERT基因的干扰质粒pYr1.1-hTERT-shRNA，将包括U6启动子在内的shRNA表达框架克隆至pcDNA3.1(-)CV-yCDglyTK中，构建新型联合基因质粒pcDNA3.1(-)hTERT-shRNA/yCDglyTK，利用U6启动子驱动shRNA表达，利用增强型CEA启动子调控融合自杀基因yCDglyTK靶向表达;
(2)成功建立4种稳定转染不同质粒的胃癌细胞株:SGC/null，SGC/shTERT，SGC/CDTK及SGC/shTERT-CDTK;Real Time-PCR及Westem blot结果发现与野生型SGC7901及SGC/null组相比，SGC/shTERT-CDTK组hTERT的mRNA水平及蛋白水平显著下降，与SGC/shTERT组相比，二者间无显著差异;SGC/shTERT-CDTK组及SGC/CDTK组mRNA水平及蛋白水平均可检测到融合自杀基因yCDglyTK的表达，其它组无表达;
(3)体外细胞实验:加入前体药物5-FC后，MTT法检测细胞生长情况，SGC/shTERT、SGC/CDTK、SGC/shTERT-CDTK与野生型SGC7901细胞及SGC/null相比较，细胞存活率下降，以SGC/shTERT-CDTK组差异显著;
(4)加入前体药物5-FC后，流式细胞技术检测SGC/null，SGC/shTERT，SGC/CDTK及SGC/shTERT-CDTK的细胞凋亡率，联合基因组诱导细胞凋亡作用最强;SGC/shTERT、SGC/shTERT-CDTK与野生型SGC7901细胞及SGC/null相比较，凋亡蛋白Bcl-2表达下调，Bax蛋白表达上调。
结论:
(1)成功构建联合基因载体pcDNA3.1(-)-hTERT-shRNA/yCDglyTK，在该载体中，hTERT及yCDglyTK都可正常表达。
(2)联合基因/5-FC治疗体系可有效杀伤胃癌SGC7901细胞。
(3)诱导细胞凋亡可能是该联合基因/5-FC治疗体系发挥作用的机制之一;该联合基因治疗/5-FC体系抗肿瘤效应可能通过线粒体通路诱导细胞凋亡起作用。
方法:
(1)选择有效靶序列并构建靶向hTERT的干扰质粒pYr1.1-hTERT-shRNA;采用PCR法从pYr1.1-hTERT-shRNA中扩增shRNA表达框架，亚克隆至融合自杀基因载体pcDNA3.1(-)CV-yCDglyTK，构建联合基因质粒pcDNA3.1(-)-hTERT-shRNA/yCDglyTK;酶切、测序等鉴定重组质粒;
(2)以磷酸钙纳米颗粒(CPNPs)为载体，介导空白质粒、靶向hTERT的干扰质粒、融合自杀基因质粒及联合基因质粒分别转染SGC7901细胞，G418筛选，建立稳定转染的细胞株，免疫荧光、Real Time-PCR及Western-blot检测目的基因表达;
(3)MTT法检测联合基因/5-FC治疗体系对胃癌SGC7901细胞的杀伤作用;平板克隆形成实验检测联合基因/5-FC治疗体系对胃癌细胞克隆形成率的影响;
(4)流式细胞仪检测细胞凋亡;Western-blot检测联合基因/5-FC治疗体系对胃癌SGC7901细胞凋亡蛋白Bcl-2及Bax蛋白表达的影响。
结果:
(1)成功构建靶向hTERT基因的干扰质粒pYr1.1-hTERT-shRNA，将包括U6启动子在内的shRNA表达框架克隆至pcDNA3.1(-)CV-yCDglyTK中，构建新型联合基因质粒pcDNA3.1(-)hTERT-shRNA/yCDglyTK，利用U6启动子驱动shRNA表达，利用增强型CEA启动子调控融合自杀基因yCDglyTK靶向表达;
(2)成功建立4种稳定转染不同质粒的胃癌细胞株:SGC/null，SGC/shTERT，SGC/CDTK及SGC/shTERT-CDTK;Real Time-PCR及Westem blot结果发现与野生型SGC7901及SGC/null组相比，SGC/shTERT-CDTK组hTERT的mRNA水平及蛋白水平显著下降，与SGC/shTERT组相比，二者间无显著差异;SGC/shTERT-CDTK组及SGC/CDTK组mRNA水平及蛋白水平均可检测到融合自杀基因yCDglyTK的表达，其它组无表达;
(3)体外细胞实验:加入前体药物5-FC后，MTT法检测细胞生长情况，SGC/shTERT、SGC/CDTK、SGC/shTERT-CDTK与野生型SGC7901细胞及SGC/null相比较，细胞存活率下降，以SGC/shTERT-CDTK组差异显著;
(4)加入前体药物5-FC后，流式细胞技术检测SGC/null，SGC/shTERT，SGC/CDTK及SGC/shTERT-CDTK的细胞凋亡率，联合基因组诱导细胞凋亡作用最强;SGC/shTERT、SGC/shTERT-CDTK与野生型SGC7901细胞及SGC/null相比较，凋亡蛋白Bcl-2表达下调，Bax蛋白表达上调。
结论:
(1)成功构建联合基因载体pcDNA3.1(-)-hTERT-shRNA/yCDglyTK，在该载体中，hTERT及yCDglyTK都可正常表达。
(2)联合基因/5-FC治疗体系可有效杀伤胃癌SGC7901细胞。
(3)诱导细胞凋亡可能是该联合基因/5-FC治疗体系发挥作用的机制之一;该联合基因治疗/5-FC体系抗肿瘤效应可能通过线粒体通路诱导细胞凋亡起作用。