背景：　　IL-1家族的新成员白介素-33（Interleukin-33，IL-33）既可作为核因子发挥转录抑制的作用，又具有细胞因子的信息传递功能。除了在细胞受损时被动释放至胞外，IL-33能否主动释放目前尚不清楚。IL-33在中枢神经系统（Central nervous system，CNS）的多种细胞核内组成性高表达，被证明与 CNS最常见的自身免疫性疾病多发性硬化症/实验性自身免疫性脑脊髓炎（Multiple sclerosis/ Experimental autoimmune encephalomyelitis，MS/EAE）具有相关性，但 CNS中的IL-33的释放特征及其对MS/EAE疾病进展的作用远未阐明。　　目的：　　阐明EAE病程中CNS中的IL-33的释放特征及对EAE疾病进展的作用，为探讨IL-33可能的生理学和病理学意义提供依据，并为治疗MS提供新的生物学靶标。　　方法：　　一、体内实验　　1．用 C57BL/6小鼠制备 EAE动物模型，根据 EAE的临床症状和疾病的发展趋势将EAE病程分为发病前期（Pre-onset）、初期（Onset）、高峰期（Peak）和慢性期（Chronic）四期，以正常的、未经任何处理（Naive）的C57BL/6小鼠为对照。在EAE病程的相应时间点取材并进行以下检测：　　（1）EAE各期脊髓组织中IL-33的表达变化：Western Blot检测总蛋白水平，免疫组化检测胞内蛋白的水平，ELISA检测脊髓组织匀浆液、释放到脑脊液（Cerebrospinal fluid，CSF）和血清中的水平，ELISA同时还检测可溶性ST2（sST2）以及IL-1β、IL-17A和TNF-α等炎症相关细胞因子水平的变化。　　（2）脊髓组织中IL-33及ST2的细胞定位：免疫荧光染色检测Naive小鼠脊髓组织切片中IL-33、ST2与星形胶质细胞（GFAP标记）、小胶质细胞（CD11b标记）以及神经元（NeuN标记）的共定位情况，并检测EAE各期IL-33和IL-33阳性细胞的荧光强度的变化。　　2．利用小鼠脑定位仪将C57BL/6小鼠进行侧脑室埋管，放置7天小鼠创伤愈合后再进行EAE造模，并于造模后的第10~20天从埋入侧脑室的导管给予IL-33 mAb处理，2μg/次/只，隔天给药。以同型抗体IgG2a和PBS组为对照。同时对小鼠EAE发病的临床症状进行评分，并于EAE高峰期（造模后第19天）取材进行以下检测：　　（1）检验IL-33 mAb中和IL-33的效果：Western Blot检测脊髓组织中IL-33的总蛋白水平，组化检测脊髓切片中胞内 IL-33的水平，ELISA检测脊髓组织匀浆液的IL-33、sST2的水平。　　（2）检验IL-33 mAb处理对CNS的影响：LFB染色检测脊髓髓鞘脱失情况，免疫组化染色检测星形胶质细胞（GFAP标记）、小胶质细胞（CD11b标记）的增殖活化以及神经元（NeuN标记）的数量变化；ELISA检测脊髓组织匀浆液的TNF-α、HMGB1等炎症相关细胞因子的水平。　　（3）检测IL-33 mAb处理对T细胞亚群的影响：脊髓切片CD3免疫组化染色检测浸润到 CNS的T淋巴细胞水平；流式细胞术检测脾脏、腹股沟和腋窝引流淋巴结Th1/17型细胞亚群的变化。　　二、体外实验　　1．IL-33在原代CNS细胞中的表达：分离培养原代星形胶质细胞、神经元，Western Blot分别检测IL-33在原代星形胶质细胞、神经元胞浆-胞核蛋白中的表达。　　2．IL-33主动释放：　　（1）培养原代星形胶质细胞，分别用脊髓组织匀浆液（Naive、Pre-onset和Peak期）、TNF-α联合 ATP处理细胞，用超滤管浓缩法将刺激后的培养上清浓缩10倍后，ELISA检测IL-33的水平，Western Blot检测细胞裂解液中IL-33的含量，台盼蓝活细胞拒染法检测细胞的生存率，GFAP荧光染色检测星形胶质细胞的活化。　　（2）培养人星形胶质母细胞瘤细胞系 U87细胞，用免疫荧光染色确定 U87细胞表达IL-33后，用PTX和/或ATP处理细胞，用超滤管浓缩将刺激后的培养上清浓缩10倍后，ELISA检测浓缩上清中IL-33的水平，台盼蓝活细胞拒染法检测细胞的生存率。　　3．EAE高峰期释放的IL-33对胶质细胞功能的调控：　　（1）对原代星形胶质细胞的作用：用EAE高峰期脊髓组织匀浆液（含有高水平IL-33）处理细胞，再加入IL-33 mAb中和IL-33，MTT检测细胞的增殖，GFAP荧光染色检测星形胶质细胞的活化。　　（2）对小胶质细胞系BV2细胞的作用：用EAE高峰期脊髓组织匀浆液（含有高水平IL-33）处理细胞，再加入IL-33 mAb中和IL-33，MTT检测细胞的增殖，NO检测反映细胞的活化；荧光微球吞噬实验检测吞噬功能。然后用 LPS模拟炎症微环境激活BV2细胞，再用重组IL-33干预LPS激活的细胞并进行以上检测加以佐证。　　结果：　　1．IL-33在EAE进展中被释放到脊髓组织局部：在Pre-onset、Onset和Peak期脊髓组织胞核内IL-33表达减少，而IL-33总蛋白并未减少，Chronic期胞核内IL-33和IL-33总蛋白均显著增加；ELISA检测发现脊髓组织匀浆上清从 Pre-onset期开始即有 IL-33释放，Peak期释放水平最高；但血清和 CSF中未检测到 IL-33；此外，脊髓组织匀浆液中的TNF-α和IL-17A等炎症相关细胞因子的水平也有所增加。　　2．脊髓组织定居细胞表达 IL-33和其受体 ST2：在正常小鼠脊髓组织中，IL-33不仅定位在星形胶质细胞的胞核中，而且还表达在神经元的胞核和胞浆中；提取原代培养的星形胶质细胞和神经元的胞浆-胞核蛋白进行Western Blot检测 IL-33进一步证实了这点。ST2主要由星形胶质细胞和小胶质细胞表达。　　3．IL-33释放的来源：　　（1）IL-33可能被神经元被动释放：在EAE进展中，胞内IL-33的减少与神经元的损伤正相关。　　（2）IL-33被星形胶质细胞主动释放：在EAE进展中，胞内IL-33的减少与星形胶质细胞的激活负相关。体外实验进一步证明在炎症刺激如脊髓组织匀浆液和 ATP能诱导原代星形胶质细胞活化并主动释放IL-33；TNF-α也能诱导原代星形胶质细胞活化并主动释放IL-33，而且这种释放不需依赖ATP；EAE造模试剂PTX和/或ATP刺激也能诱导U87细胞主动释放IL-33。　　4．CNS局部给予IL-33 mAb处理加重EAE：EAE发病期侧脑室给予IL-33 mAb处理，EAE的临床症状、CNS的组织损伤（脱髓鞘）、T淋巴细胞浸润和炎症加重；同时，星形胶质细胞、小胶质细胞活化增加，而外周 Th1/17细胞的比例和数量不受影响。　　5．EAE高峰期释放的IL-33调控胶质细胞的功能：　　（1）IL-33抑制星形胶质细胞的增殖。　　（2）IL-33抑制小胶质细胞的增殖和活化，同时促进其吞噬功能。　　结论：　　1．在正常小鼠脊髓组织中，IL-33主要由星形胶质细胞和神经元表达；ST2主要由星形胶质细胞和小胶质细胞表达。　　2．在EAE进展中，受损神经元可能被动释放IL-33，激活的星形胶质细胞主动释放IL-33到脊髓组织局部，以旁分泌或自分泌的方式发挥作用。　　3．CNS局部给予IL-33 mAb处理加重EAE。　　4．EAE高峰期释放的IL-33抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的增殖、活化，同时促进小胶质细胞的吞噬功能。　　综上，CNS来源的IL-33在EAE炎症的刺激下释放到脊髓组织局部，抑制T淋巴细胞浸润到 CNS和星形胶质细胞、小胶质细胞的增殖活化，减轻 CNS局部的炎症，从而抑制EAE的加重。