中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是一种经济蟹类,具有很高的经济价值。苹果酸脱氢酶（Malic Dehydrogenase,MDH）是氧化还原酶类,对生物体能量代谢起着关键作用,在细胞基质中和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶一起催化合成苹果酸,同时为细胞质基质和细胞器之间的活动提供能量。组织蛋白酶D（cathepsind,CAT-D）属于真核生物溶酶体中天冬氨酸蛋白家族,能够水解蛋白和多肽;在雄性生殖方面组织蛋白酶与精荚排出体外后的硬化有直接关系,并与后续的精荚基质的水解以及精子的释放相关,组织蛋白酶能促进细胞穿过血睾屏障,有助于精子从生精上皮释放到管腔中,并清除曲精细管内死伤精细胞和生精上皮的残留物。本课题通过聚合酶链式反应获得MDH和CAT-D的基因片段,并构建MDH和CATD的表达菌株,通过镍柱与His标签的特异性结合获得高纯度蛋白。利用多克隆抗体制备技术获得CAT-D的多克隆抗体,利用单克隆抗体制备技术获得MDH的单克隆抗体,通过Western blot、免疫荧光技术和免疫电镜技术探究MDH和CAT-D在精子中的分布特征,分析MDH和CAT-D在精子顶体反应中的功能。实验结果:本课题成功构建MDH和CAT-D的表达菌株,经过诱导表达成功得到CAT-D和MDH的体外表达蛋白,经过质谱验证为MDH和CAT-D蛋白。通过单抗体制备技术获得MDH的单克隆抗体其效价达到:204800;通过多克隆抗体制备技术获得CAT-D的多克隆抗体,其效价达到1:102400。通过免疫印迹实验验证MDH单克隆抗体能够特异性识并别结合MDH蛋白,CAT-D多克隆抗体能够特异性识别并结合CAT-D蛋白。利用免疫荧光技术发现,CAT-D分布在中华绒螯蟹精子的顶体管或者头帽部分;MDH分布在精子的两部分:顶体管和顶体囊。利用免疫电镜技术发现,CAT-D主要定位在中华绒螯蟹精子的头帽下方并成线性分布,推测与顶体囊外翻、顶体膜破裂相关;另外在顶体囊中间层部分有较少的零散分布,推测与片层结构脱落相关,使精子最终只剩下精子核、头帽和顶体管。MDH定位在中华绒螯蟹精子顶体管和顶体囊部分,推测是MDH为顶体囊外翻、顶体管前伸和片层结构脱落这些过程提供能量。本课题初步探究分析MDH和CAT-D蛋白在精子中位置及相关作用,为探明中华绒螯蟹顶体的形成、反应和受精的分子机制提供基础依据。