人乳铁蛋白基因乳腺表达载体构建及细胞表达

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β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)是反刍动物最主要的乳清蛋白,在人和啮齿动物乳中都不存在。基质结合区(matrix attachment Region)是真核基因组的DNA 序列中能特异地和核基质紧密结合的区域,它广泛地存在于从酵母到人的所有真核生物基因组中。本试验以山羊β-乳球蛋白基因(BLG)5′端的调控序列为启动子和人基质结合区(MARs)序列为增强子,构建了人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体。然后利用脂质体法转染体外培养的山羊乳腺上皮细胞。通过G418 筛选细胞,为本实验室利用核移植技术生产转基因动物提供细胞来源。结果如下: 1.利用PCR 方法克隆了山羊BLG 基因5′端的调控序列(2248bp),其中包括第一外显子和第一内含子。然后将其克隆在pMD18-T Vector 的T 位点。测序表明,克隆序列和原序列同源性为99.70%,其中在-684 处缺失碱基C,在-860 处碱基G 突变为A。Blast 分析表明,克隆的山羊BLG 基因的调控区和绵羊的BLG 基因调控区同源性为96.09%,和奶牛的BLG 基因的A 型和B 型基因的同源性分别为90.55%和91.79%。 2.将克隆的山羊BLG 基因5′端调控序列连接在真核表达载体pEGFP-C1,取代原来表达载体上的启动子CMV,构建pBLG-GFP 乳腺表达载体。将pBLG-GFP 乳腺表达载体用脂质体转染体外培养的乳腺上皮细胞,48h 后荧光显微镜检测报告基因表达,发现报告基因有良好的表达。证明了克隆的山羊BLG 基因5′端调控序列的有效性和合理性。 3.用Ase I 和Hind Ⅲ双酶切质粒pBLG 和真核表达载体pEGFP-C1,电泳后回收目的片断,然后T4DNAligase 连接,得到初级载体pEB。再用Hind Ⅲ和Sal I 双酶切质粒pLF 和pEB,电泳后回收目的片断,然后T4DNAligase 连接,得到中间表达载体pBL。最后用BamH I 和Sal I 双酶切质粒pBL 和pMR,电泳后回收目的片断,然后T4DNAligase 连接,得到最终表达载体pBLM。此载体含有调控成分、目的基因、人基质结合区序列和抗性基因。 4.利用脂质体转染体外培养的乳腺上皮细胞,G418 的培养液连续筛选2 周,然后利用有限稀释法稀释培养,细胞提取DNA 进行PCR 鉴定,结果表明目的基因整合到了细胞的染色体上。
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