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拟穴青蟹(Scylla paramamosain),简称青蟹,是我国东南沿海重要的经济蟹类养殖品种。然而,在养殖过程中因易受到微生物感染,青蟹死亡率较高,其中受细菌和真菌的感染报道较多。在生物体先天性免疫系统中,抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)是非常重要的免疫因子,在外源病原体入侵时起到防御保护的作用。迄今从青蟹中已经分离鉴定出十多种抗菌肽,大多数抗菌肽只具有抑杀细菌而不具有抑杀真菌的活性。饲料霉变也是制约水产养殖产业健康发展重要因素之一。化学防霉剂作为饲料添加剂虽然能有效防止饲料发霉,但化学防霉剂不仅会影响饲料的适口性,残留在饲料中的防霉剂还可能影响所食动物的健康。因此,获得高抗真菌活性的抗菌肽具有重要的科学意义和应用价值。在本实验室前期建立的青蟹胚胎至幼体不同发育阶段的转录组数据库基础之上,本研究从中进行深入分析和筛选,获得了一种尚未报道抗菌肽Sp-AMP。本文对该抗菌肽基因的表达特性、抗菌活性及其结构域特性等进行了细致分析,并初步探索了该活性结构域的抗真菌机制,取得以下研究结果:1.筛选获得了一种新型的青蟹抗菌肽Sp-AMP基因:从本实验室青蟹胚胎至幼体不同发育阶段的转录组数据库中分析发现,Sp-AMP在青蟹胚胎和幼体整个发育阶段的表达水平较低。在青蟹溞状幼体Ⅰ期、大眼幼体时期及仔蟹时期,LPS刺激或溶藻弧菌感染不能显著诱导或抑制Sp-AMP的表达,但在雌性成蟹的卵巢中表达水平较高,说明该抗菌肽仍然是一种性腺相关的抗菌肽。2.克隆获得了青蟹Sp-AMP基因的编码序列:通过RACE技术及序列拼接获得了 Sp-AMP基因的全长cDNA序列。Sp-AMP基因的cDNA全长为573 bp,其中5’非编码区(5’ Untranslated Region,5’-UTR)为181bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)为 231 bp(含终止密码子 TGA),3’ 非编码区(3’ Untranslated Region,3-UTR)为161 bp。Sp-AMP基因开放阅读框编码的Sp-AMP蛋白中含有1个信号肽,其切割位点位于第22个(丝氨酸)和第23个(丙氨酸)氨基酸之间;Sp-AMP成熟肽二级结构主要由α-螺旋和β-折叠组成,并含有类似植物抗菌肽结构域(Antimicrobial21 domain)的功能区。3.揭示了 Sp-AMP基因在正常青蟹组织中的表达分布:在正常的雄蟹和雌蟹各个组织中均检测到不同丰度的Sp-AMP转录本,其中主要在雄蟹的精巢、后射精管含促雄腺以及肌肉组织中高水平表达;在雌蟹的卵巢和肌肉组织中的转录水平也较高,但雄性的转录表达水平要高于雌性。4.确定了抗菌肽Sp-AMP具有高抗菌活性的结构域:根据抗菌肽Sp-AMP蛋白二级结构和功能结构域的预测结果,对Sp-AMP进行蛋白分段设计,得到Sp-AMP1-25、Sp-AMP26-54和Sp-AMP1-54;通过化学合成获得各分段肽,并对各分段肽进行了抗菌活性检测,发现分段肽Sp-AMP26-54具有显著的抗菌活性,且抗菌谱更广。5.阐明了抗菌肽Sp-AMP26-54的抗菌特性:Sp-AMP26-54对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,如溶壁微球菌(Micrococcus lysodikticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtiis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、荧光假单胞菌(Psdeuomnoda fluorescens)、施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)等均有明显的抑杀作用,其最小抑菌浓度(MIC)为3-6μM;对酵母真菌,如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和毕赤酵母GS115(Pichia pastoris GS115)的最小抑菌浓度为1.5-3μM。对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysorum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)等丝状真菌也具有较好的抑杀作用,其最小抑菌浓度均低于24μM。Sp-AMP26-54对金黄色葡萄球菌和新型隐球菌的抗菌活性均具有良好的热稳定性;对金黄色葡萄球菌的抗菌活性具有良好离子耐受性,但对新型隐球菌的抗菌活性易受阳离子的影响。杀菌动力学曲线表明,Sp-AMP26-54与金黄色葡萄球菌共孵育5min时,杀菌指数达到50%,共孵育180min时杀菌指数达到100%;Sp-AMP26-54与新型隐球菌共孵育10 min时,杀菌指数达到50%,共孵育360min时杀菌指数达到100%。此外,Sp-AMP26-54对小鼠肝实质细胞和人正常肝细胞无明显的细胞毒性,对人宫颈癌细胞和人肝癌细胞无明显的抗肿瘤活性。6.初步揭示了 Sp-AMP26-54的抗真菌机制:Sp-AMP26-54能够抑制尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌、黑曲霉、赭曲霉和烟曲霉等丝状真菌孢子的萌发,还能抑制黑曲霉菌丝的生长。扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)结果显示,Sp-AMP26-54处理后的黑曲霉孢子、禾谷镰刀菌孢子、赭曲霉孢子和新型隐球菌细胞表面变得粗糙,细胞结构遭到严重破坏;流式细胞荧光分选(Fluorescence activated Cell Sorting,FACS)结果表明Sp-AMP26-54能够改变新型隐球菌细胞膜的通透性;共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)观察结果表明Sp-AMP26-54蛋白能够定位于细胞表面,细胞内无Sp-AMP26-54蛋白荧光信号。