性信息素结合蛋白(Pheromone binding proteins,PBPs)在鳞翅目昆虫性信息素感受中起重要作用。近年研究发现,夜蛾科昆虫至少含有3个不同的PBP基因,但对于其功能分化及在性信息素感受中的相对重要性缺乏活体研究。CRISPR/Cas9基因编辑技术源于细菌和古细菌体内发现的一种获得性免疫机制,通过人工的改造,目前已成功的运用于多种生物,成为一种方便高效的基因功能研究工具。本研究以多食性夜蛾科害虫斜纹夜蛾为对象,首次利用CRISPR/Cas9技术对3个PBP基因分别进行敲除并获得相应的纯合突变品系,然后利用电生理和行为测定技术阐述了斜纹夜蛾3个不同PBP基因在性信息素感受中的功能及相对重要性,研究结果对于明确夜蛾科昆虫性信息素分子感受机制及设计和开发更为高效的基于嗅觉的害虫防控技术有重要意义。此外还克隆了斜纹夜蛾的BLOS2基因,利用CRISPR/Cas9技术明确了其在幼虫表皮颜色形成中的决定性作用,为斜纹夜蛾及其他夜蛾类昆虫的基因工程研究提供一个重要的标记基因。本研究同时为斜纹夜蛾及其他鳞翅目害虫的基因编辑提供了重要技术参考。主要研究结果如下:1.运用CRISPR/Cas9技术对斜纹夜蛾PBP1基因的功能研究根据sgRNA靶标位点设计原则,在斜纹夜蛾PBP1基因的第2个外显子上选择一个靶标位点。所设计的sgRNA在临近PAM序列处选择限制性内切酶HpyCH4 Ⅲ的酶切位点,用于突变检测。将体外转录合成的sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到产出不超过6个小时的卵内,24小时后随机挑选20粒虫卵,抽提基因组DNA,特异性引物扩增包含靶标位点的片段,然后利用HpyCH4 Ⅲ进行酶切检测,所得敲除的效率为51.5%。PCR产物测序表明在靶标位点上发生了突变;同时单克隆测序结果显示有不同类型的碱基插入、缺失和插入缺失混合类型的突变发生。通过生物信息学的手段,预测了可能发生突变的位点,PCR克隆检测了可能性最大的前12个脱靶位点,没有产生脱靶效应。通过单对系交配策略,最终成功选育到2个碱基插入的纯合突变品系,导致PBP1蛋白翻译提前终止,终止后剩余104个氨基酸(野生型165个),其中只包含3个保守的半胱氨酸(野生型6个);PBP基因6个保守的半胱氨酸两两结合形成3个二硫键,进而形成一个稳定的结合腔用来运输信息素气味分子;PBP1基因被突变后,只剩下3个保守的半胱氨酸,不能形成稳定的结合腔,所以导致PBP1基因的功能丧失。通过触角电位和行为学实验分别验证了 PBP1基因缺失后雄虫触角电位和行为的变化。PBP1突变雄虫对性信息素主组分(Z9,E11-14:Ac)的电位反应在高剂量(100、500和1000ng)时均显著降低50%左右;对第二种组分(Z9,E12-14:Ac)在500 ng剂量时电位反应降低40%左右;对第三种组分(Z9-14:Ac)在500和1000 ng剂量下降30%左右。通过Y型嗅觉仪及直接刺激法进一步测定了突变雄虫的行为学反应。在Y型管实验中,当用主组分刺激时,83.3%的野生型雄虫趋向性信息素,而只有33.3%的PBP1突变雄虫选择性信息素。在用50ng剂量的主组分直接刺激时,野生雄虫和突变雄虫分别有100%和50%的个体振翅并散开味刷,分别有33%和17%的雄虫试图交尾。为探讨PBP1可能参与的生理过程,利用RNA-seq检测了纯合突变个体触角内相关基因的表达量变化。FPKM结果显示,与野生型个体比较,PBP1突变个体触角中有103个基因的表达量上调,398个基因表达量下调。代谢通路(pathway)富集分析显示,差异基因数量排在前2位的是尼古丁成瘾信号通路和味觉传导信号通路,排在第9位的是钙离子信号传导通路。差异基因CGO注释发现,信号传导机制的GO生物过程中所属的差异基因最多。2.斜纹夜蛾PBP2和PBP3基因的活体功能研究分别在PBP2和PBP3基因的第2个外显子上选择一个靶标位点,分别选择限制性内切酶BseR Ⅰ和Xcm Ⅰ的酶切位点进行突变的酶切检测。通过将体外转录合成的sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到新产出的虫卵内,24小时后分别随机挑选20粒虫卵,抽提基因组DNA,特异性引物扩增包含靶标位点的片段,酶切检测表明,PBP2和PBP3基因都在靶标位点处成功地产生了突变,突变效率分别大约为46.8%和39%左右。同时PCR产物测序检测了 PBP2和PBP3基因最可能发生脱靶的8个位点,均未有脱靶发生。通过单对系交配策略,成功筛选到15个碱基缺失和5个碱基插入的PBP2基因纯合突变品系,4个碱基缺失和10个碱基插入的PBP3基因纯合突变品系,PBP2和PBP3蛋白翻译均提前终止。PBP2蛋白终止后剩余114个氨基酸(野生型171个),其中包含5个保守的半胱氨酸(野生型6个);PBP3蛋白终止后剩余77个氨基酸(野生型165个),其中包含2个保守的半胱氨酸(野生型6个)。由于半胱氨酸的缺失,导致PBP2和PBP3蛋白功能丧失。然后,分别测定了 PBP2和PBP3突变雄虫对性信息素组分的EAG反应。PBP2基因突变后,雄虫触角对性信息素组分主组分的电位反应在10、100、500和1000ng剂量刺激下EAG电位反应值平均降低70%左右;对于第二种组分的(1、10、100、500和1000 ng)EAG反应值平均降低60%左右;对于第三种组分的EAG反应值只在1000 ng刺激下降低40%左右;PBP3基因突变后,雄虫触角对于100、500和1000 ng剂量性信息素主组分的电位反应平均降低30%左右;野生型和PBP3突变的雄虫触角对第二种性信息素组分的EAG反应之间没有差异;雄虫触角对第三种性信息素组分的EAG反应值只在500 ng剂量的刺激下电位反应降低50%左右。Y型管测定发现,野生型雄虫有83%选择性信息素主组分,而PBP2基因突变的雄虫只有50%选择性信息素主组分。同时,根据行为学试验结果,在5 ng剂量性信息素主组分的刺激下,50%的野生型雄虫振翅并散开味刷,而PBP2基因突变的雄虫33.3%振翅,17%散开味刷;当利用50 ng性信息素主组分刺激的时候,100%的野生型雄虫振翅并散开味刷,其中42%试图寻找雌虫交配;而PBP2突变的雄虫只有33%振翅,其中25%试图寻找雌虫交配。3.斜纹夜蛾BLOS2基因的克隆、序列分析和功能研究利用从NCBI下载的家蚕BLOS2基因序列,在斜纹夜蛾转录组数据里面比对得到了一个BLOS2同源片段。通过序列比对分析和其他昆虫BLOS2基因有很高的相似性,然后克隆获得了 BLOS2基因的cDNA和基因组DNA全长。实时定量PCR表明BLOS2基因在1龄幼虫表达量最高,在卵期和2龄幼虫期表达量也较高,在其他幼虫龄期及成虫期表达显著降低。进一步利用CRISPR/Cas9技术研究了斜纹夜蛾BLOS2基因的功能。卵中注射sgRNA/Cas9mRNA后当代(G0代),即获得了幼虫表皮颜色马赛克状缺失的嵌合突变个体,嵌合个体的百分率为62.3-70.6%。G0代嵌合体雌雄交配,在G1代成功筛选到了一头幼虫期表皮黄色条纹和白色斑点全部消失的突变体,揭示了 BLOS2基因在幼虫表皮颜色形成中的重要作用。斜纹夜蛾BLOS2基因的突变表型明显且穗定,因此可以作为一个理想的标记基因,用于基因编辑的相关研究中,同时本研究的思路和方法也为CRISPR/Cas9系统应用于其他鳞翅目昆虫基因功能的研究提供借鉴。