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柑橘是我国种植面积和产量最大的水果作物,对农村经济发展起着重要的作用。随着人民生活水平的提高,对柑橘营养品质日益重视。类黄酮是柑橘的重要的次生代谢物质,不仅参与柑橘抗病、虫、干旱、低温等生物和非生物胁迫,也是柑橘的重要功能营养成分,对人体健康有很好的保健作用。因此解析柑橘中类黄酮代谢的遗传及转录调控机制,通过遗传改良提高柑橘的营养品质日趋重要。目前柑橘类黄酮生物合成主要通路上一些结构基因的功能研究已经较为清晰,但其转录调控机制尚未清晰阐明。挖掘柑橘类黄酮生物合成相关的转录因子并鉴定其功能是阐明柑橘类黄酮生物合成遗传调控机制的重要基础。本研究以不同遗传背景的柑橘为实验材料,通过转录组比较分析,系统进化分析以及转基因等方法,开展柑橘类黄酮合成相关转录因子的挖掘与功能研究。主要研究结果如下:（1）与次生代谢相关的差异表达基因为鉴定柑橘中与类黄酮生物合成相关的基因,对巴西酸橙（Citrus aurantium L.,Brazil sour orange）及本地早橘（Citrus reticulata Blanco,Bendizao mandarin）花后100天及160天果皮的转录组进行了比较分析。通过比较花后160天与花后100天的果实转录组,从巴西酸橙中共检测到2897个差异表达基因,从本地早橘中共发现2476个差异表达基因。进一步分析发现巴西酸橙与本地早橘共享1290个差异表达基因。经GO及KEGG功能注释,这些共有的差异表达基因主要集中在光合作用、氨基酸代谢以及苯丙烷生物合成途径上。说明在果实发育过程中,与次生代谢物生物合成尤其是与苯丙烷生物合成途径相关的基因的表达有较大的变化,其中有许多差异表达基因和类黄酮的代谢相关。（2）柑橘类黄酮合成相关转录因子挖掘为了挖掘与类黄酮生物合成相关的转录因子,对共有的1290个差异表达基因与类黄酮生物合成途径中的关键结构基因Cit CHS2进行相关性分析。共筛选到392个与Cit CHS2的表达显著相关的基因（|R|＞0.6,p＜0.05）。这些基因主要富集在MYB、Dof、ERF等转录因子家族。通过分析类黄酮生物合成途径中已知结构基因启动子的顺式作用元件,发现这些基因的启动子上存在较多的MYB转录因子结合位点,因此重点对与Cit CHS2的表达量具有高度相关性的MYB转录因子进行分析,共鉴定到5个MYB转录因子。其中Cit DIV2（Ciclev10029205m）与Cit CHS2的表达水平正相关,Cit MYB81（Ciclev10026107m）、Cit MYB82（Ciclev10001979m）、Cit MYB21（Ciclev10021699m）、Cit MYB33（Ciclev10012152m）与之负相关。同时,利用类黄酮生物合成途径中已知结构基因的启动子预测到了60个潜在的转录因子。将这60个MYB与以上5个MYB基因取交集分析后发现其共享2个R2R3-MYB基因,Cit MYB21和Cit MYB33。系统进化分析发现Cit MYB33与R2R3-MYB基因家族中的第1亚族聚为一支,而Cit MYB21属第2亚族。（3）Cit MYB21的表达及与类黄酮含量的相关性为了解析Cit MYB21基因的功能,首先对Cit MYB21在不同条件下的表达与类黄酮含量的相关性进行了分析。q RT-PCR（荧光定量PCR）和类黄酮含量检测分析发现在黑暗、低温、Me JA以及SA胁迫处理后,柑橘植株的叶片中类黄酮含量发生了变化,但与Cit MYB21基因的表达量并没有显著的相关关系。对不同种质、不同组织部位、叶片及果实不同发育时期的样品进行分析发现,Cit MYB21基因的表达不仅具有显著的种质特异性,还具有明显的时空特异性,在根中特异性高表达并随着果实、叶片的成熟其表达表现出先升高后降低的趋势。对类黄酮含量与Cit MYB21基因的表达水平进行相关分析发现,Cit MYB21基因的表达量与不同种质中类黄酮的含量存在显著的负相关（R=-0.38,p＜0.001）,同时在不同组织部位以及果实及叶片发育过程中Cit MYB21基因的表达水平与类黄酮含量也存在着显著负相关（R=-0.88,p＜0.001;R=-0.66,p＜0.05;R=-0.49,p＜0.05）。（4）Cit MYB21的功能验证从北碚447锦橙（Citrus sinensis Osbeck,Beibei447 Jincheng）叶片中克隆得到了Cit MYB21基因的编码区序列。该基因的CDS（Coding sequence）全长为804 bp,编码267个氨基酸。为进一步解析Cit MYB21基因的生物学功能,构建了过表达载体及VIGS（病毒诱导的基因沉默）载体用于柑橘的瞬时转化。共筛选出5株基因沉默的植株和3株空载对照植株。与空载对照相比,沉默植株叶片中的Cit MYB21表达水平显著降低,分别下调了67%、79%、52%、55%、54%,类黄酮含量显著升高,分别上升了11%、43%、29%、12%、34%。瞬时转化过表达的果皮中Cit MYB21基因的表达水平比对照平均高1倍,类黄酮含量显著下降。表明Cit MYB21负调控类黄酮在柑橘中的积累。为探索Cit MYB21负调控类黄酮积累的机制,分析了不同组织部位、叶片不同发育时期、以及转基因植株中类黄酮生物合成途径中主要结构基因的表达情况。相关性分析结果显示Cit CHS2和Cit CHI两个结构基因在转基因株系中和Cit MYB21的表达呈极显著的负相关,但在不同的组织部位和叶片发育过程中并没有表现出显著的负相关。其它结构基因也没有表现出与Cit MYB21的表达呈明显的相关关系。综上所述,本研究发现了R2R3-MYB中的第2亚族基因Cit MYB21与柑橘类黄酮含量显著负相关,该转录因子在柑橘中的表达具有明显的时空特异性,说明Cit MYB21可能是负调控类黄酮的生物合成,是影响类黄酮在柑橘中时空分布的重要遗传调控因子。