论文部分内容阅读
L-脯氨酸是具有一定生理活性的杂环族氨基酸,目前在工业、农业、医药和食品等领域得到了广泛的应用。L-脯氨酸的发酵生产从上世纪90年代开始就几乎没有发生大的变动,因此,提高产品的市场竞争力的主要核心就在于如何进一步提高产酸能力和糖酸转化率、降低生产成本。本研究以实验室保藏的一株生产L-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）P1作为出发菌,经过硫酸二乙酯（Diethyl sulfate,DES）和常温常压等离子体（Atmospheric and room temperature plasma,ARTP）的逐级诱变,筛选获得一株高产L-脯氨酸的突变株SG-56。然后,通过单因素实验、响应面设计等方法在摇瓶水平上对突变株SG-56的发酵培养基和发酵条件进行了优化,确定了L-脯氨酸摇瓶发酵的工艺条件,并在5 L发酵罐中对补料分批发酵过程中的部分参数进行了优化。最后对出发菌和突变菌的胞内代谢流量进行了比较和分析。主要的研究结果如下:（1）通过逐级诱变提高C.glutamicum P1产L-脯氨酸的能力。以C.glutamicum P1作为出发菌,经过DES和ARTP逐级诱变处理,利用磺胺胍（sulfaguanidine,SG）抗性平板和琥珀酸为唯一碳源平板对菌株进行筛选,最终筛选出一株高产L-脯氨酸的突变株SG-56,在未优化发酵条件情况下可产生48.71 g·L-1 L-脯氨酸,较出发菌产酸水平提高了19.4%。（2）优化菌株SG-56生产L-脯氨酸的培养基组分和摇瓶发酵条件。利用浓度梯度实验和响应面设计对发酵培养基组分中的碳源、氮源、无机盐和生物素进行了优化,获得优化培养基后,进一步考察了p H、接种量、装液量和摇瓶类型等因素对菌株产酸能力的影响。优化后的培养基(g·L-1):葡萄糖161.6,酵母蛋白胨7.92,玉米浆干粉4.0,（NH4）2SO4 50.4,KH2PO4 0.94,Mg SO4·7H2O 0.5,Fe SO4·7H2O 0.01,Mn SO4·4H2O 0.01,生物素2.0×10-4,硫胺素1.0×10-4,Ca CO3 40.0;最适的摇瓶发酵条件:初始p H 7.5,接种量4%,装液量25 m L/500 m L,挡板摇瓶。在上述工艺条件下,摇瓶发酵48 h可积累55.18±0.74 g·L-1 L-脯氨酸,较优化前提高了14.8%。最后探究了不同表面活性剂对菌株SG-56发酵生产L-脯氨酸的影响。实验结果发现,在发酵15 h添加2 g·L-1 Tween 80可以提高其产酸能力。（3）在5 L发酵罐水平对菌株SG-56的补料分批发酵参数进行优化。通过对玉米浆干粉浓度、初始葡萄糖浓度、残余葡萄糖浓度和溶氧水平等参数进行优化,实验结果表明,玉米浆干粉浓度为2 g·L-1,初糖浓度为60 g·L-1,残糖浓度维持在10 g·L-1,溶氧水平控制在35%左右,对L-脯氨酸的积累更为有利。在此条件下进行补料分批发酵,最终L-脯氨酸产量可达75.84 g·L-1,糖酸转化率为0.318 g·g-1,分别较优化前提高了15.9%和34.1%。（4）L-脯氨酸生物合成的代谢通量分析。基于代谢通量分析理论和L-脯氨酸生物合成的代谢途径,构建了L-脯氨酸生物合成的代谢网络模型,然后研究了出发菌P1及突变菌SG-56的胞内代谢流量分布情况。结果表明,出发菌P1及突变菌SG-56在丙酮酸节点处的流量分布情况有较大变化,在突变株SG-56中由丙酮酸节点处流向L-脯氨酸的代谢流量为43.21 mmol·L-1·h-1,与出发菌P1相比提高了31.1%(32.96 mmol·L-1·h-1),而在突变株中由丙酮酸流向“杂酸”和“副产物”的代谢流量分别为17.26 mmol·L-1·h-1和39.53 mmol·L-1·h-1,与出发菌相比分别下降了31.3%和5.7%(25.14 mmol·L-1·h-1和41.90 mmol·L-1·h-1)。