背景和目的：鳞状细胞癌是头颈部恶性肿瘤最常见的类型,占头颈部恶性肿瘤的90%以上,同时头颈部鳞癌占全身恶性肿瘤的7-8%。口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma OSCC)占头颈部恶性肿瘤发病率第1位,其恶性程度较高,生长快,浸润性较强,易发生颈部淋巴结转移,局部复发和颈部淋巴结以及全身转移是其致死的主要原因。尽管现在的治疗手段和方法得到了很大的提高,但是在过去的30年口腔鳞癌的发病率和死亡率并没有得到明显的改观,口腔鳞癌患者的5年总生存率在40%-50%之间变化。晚期口腔鳞癌多呈浸润性生长,已浸润周围组织和已经发生远处转移的肿瘤外科手术较完全切除,而且传统放化疗效果难言满意,因此对于存在周围浸润广泛及远处转移的口腔鳞癌阐明其发病机制,寻找新治疗靶点十分重要。肿瘤的侵袭转移是指肿瘤细胞脱离其原发部位,向周围传播,浸润正常组织,并通过血液循环、淋巴引流、种植等方式转运到继发靶组织或器官继续增殖生长,形成与原发肿瘤相同性质的继发肿瘤的过程。肿瘤的侵袭转移是多基因参与、多步骤完成的复杂过程,肿瘤细胞间的粘附减弱和肿瘤细胞运动能力增强是肿瘤发生侵袭转移的基础。多项研究已经证实,上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)在肿瘤的侵袭和转移过程中扮演了重要角色。EMT的概念在1982年被Greenbwg和Hay首次提出,是指在某些特殊的生理或病理条件下,具有极性的上皮细胞失去极性,转换成具有活动能力、能够在细胞基质问自由移动的间质细胞的过程；正常情况下,EMT见于胚胎发育早期原肠胚形成,神经脊形成,心脏瓣膜形成以及伤口愈合等过程中。而胚胎发育,伤口愈合及肿瘤时EMT发生过程又不尽相同,因此有学者建议将EMT分为三种类型：即发育型(Ⅰ型),纤维化和伤口愈合型(Ⅱ型)及癌症性(Ⅲ型)各型EMT均以上皮细胞极性的丧失及间质特性的获得为重要特征,具体包括：①细胞黏附分子(E-cadherin)表达减少,导致细胞间连接解体,细胞分散；②角蛋白为主的细胞骨架转变为波形蛋白为主的细胞骨架。细胞骨架重排,形成细胞-基质黏附,引起细胞表型的改变,细胞运动能力增强,因此上皮来源的肿瘤细胞转移可能通过EMT引起。目前已发现乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、食管癌、头颈部麟癌等多种人类肿瘤中均存在EMT现象。EMT的发生是微环境与细胞相互作用的结果,正常情况下促进EMT发生的胞外刺激,细胞膜或胞内受体,细胞内信号转导及转录因子都有可能在肿瘤微环境下,因不适当的表达及调控造成病理性EMT。近年来,上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在恶性肿瘤侵袭转移过程中可能发挥关键作用受到广泛关注。成纤维细胞激活蛋白(FAP)作为丝氨酸蛋白酶家族的成员,在激活的间质中表达,参与不同的生理和病理生理过程,如胚胎发育、伤口愈合、慢性炎症和恶性肿瘤等。曾被认为是F19细胞表面抗原,是一种可诱导的细胞表面糖蛋白,它最初是在1986年用单克隆抗体F19在培养的成纤维细胞中发现的。1994年,F19细胞表面抗原被命名为成纤维细胞活化蛋白(FAP)。1990年,一个分子量为170kDa的胶原酶在人类的恶性黑色素瘤细胞株LOX中被识别。1994年,这个170kDa的胶原酶被命名为Seprase。对FAP和Seprase的分子克隆研究发现它们是同一种细胞表面丝氨酸蛋白酶,基因定位于2q23。FAP是一种膜结合糖蛋白,属于丝氨酸蛋白酶类,由FAPa(分子量95kDa)和FAPβ(分子量105kDa)两个亚单位组成分子量为170kDa的二聚体。FAP具有两种蛋白水解酶活性,首先是胶原酶活性,其次是二肽肽酶活性。由于FAP是一种丝氨酸蛋白酶,能够降解许多二肽和Ⅰ型胶原和明胶,还可降解细胞外基质(EXtracellularmatrix,ECM)的多种成分[5“]另外,FAP通过解离与基质蛋白结合的生长因子,发挥促肿瘤微血管生成及促肿瘤细胞生长的作用,从而对肿瘤的浸润、转移及逆转具有重要意义。它的这种蛋白分解活性可见于原发性人上皮性肿瘤中,因此FAP在肿瘤间质的形成、再塑和维持上可能起重要作用。肿瘤间质中表达FAP的成纤维样细胞可促进肿瘤细胞增殖和侵袭、影响肿瘤细胞凋亡、并与恶性肿瘤病人的不良预后密切相关。针对肿瘤间质FAP新的肿瘤诊疗策略,吸引越来越多的研究者关注。一般认为FAP主要表达于上皮性恶性肿瘤的间质中激活的成纤维细胞中,并不见于癌细胞、正常成纤维细胞或其他正常组织,它的存在与肿瘤侵袭,肿瘤血管生成,和随后的生长和转移有关。但是近来也有文献报道FAP也表达胃,结直肠,乳腺,子宫颈和前列腺的癌细胞中。目前有关FAP在口腔鳞状细胞癌中的研究仅有几篇中文报道,主要集中在口腔鳞状细胞癌组织表达及临床意义,都证实表达于癌间质成纤维细胞。然而我们发现口腔鳞癌细胞系KB也表达FAP,并首次探讨了其在口腔鳞癌细胞中的作用及其分子机制,为进一步研究FAP,应用于诊断、治疗、判断预后提供基础。FAP是否与口腔鳞癌EMT有关?文献报道FAP是参与肿瘤EMT的一个重要调控因子。口腔鳞癌癌细胞干扰FAP后,其形态发生改变,由梭形、类似于成纤维细胞的形态变成典型的圆形或卵圆形,该形态的变化有可能是由间质-上皮转化(MET)引起。FAP干扰后的侵袭迁移功能实验以及动物转移模型结果显示口腔鳞癌细胞的侵袭迁移能力发生显著变化,主要涉及了PTEN-PI3K-AKT和Ras-MEK-ERK两条信号途径。由此我们推测FAP可能在口腔鳞癌EMT中发挥重要作用。本研究重点探讨FAP基因与口腔鳞癌EMT的关系及其参与的信号通路,旨在揭示FAP参与口腔鳞癌转移的途径,增加对FAP这个功能未知基因的新认识,为肿瘤转移机制的研究提供新线索。方法：1.FAP在口腔鳞癌组织中的表达情况及其临床意义应用免疫组化S-P法,检测南方医院口腔科2010年2月～2012年7月收治的84例口腔鳞癌组织和相应的12例正常口腔黏膜组织中FAP蛋白的表达情况,计算口腔鳞癌癌组织FAP阳性表达与临床病理学参数之间的关系,进行统计学分析。应用细胞免疫荧光检测FAP在口腔鳞癌细胞株KB以及Tca-8113表达定位。2.FAP沉默后生物功能学的变化。利用已构建的FAP干扰载体包装慢病毒在转染口腔鳞癌细胞KB,通过GFP标记流式分选获得FAP干扰单克隆,并对其进行扩大培养,再用荧光定量RT-PCR、 Western blotting检测稳定干扰的效果；同时利用阳离子脂质体瞬时转染siRNA,再用荧光定量RT-PCR、Western blotting检测瞬时干扰的效果。分别筛选出干扰效率最高的两个片段稳定转染以及瞬时转染的单克隆细胞株同时行Transwell Boyden、划痕实验、细胞粘附性实验、TRITC-鬼笔环肽检测细胞形态变化、裸鼠成瘤肝转移模型以检测FAP干扰后口腔鳞癌细胞侵袭转移能力的改变。3.FAP参与口腔鳞癌EMT的可能信号通路利用Western Blotting检测FAP沉默后口腔鳞癌细胞中EMT相关信号蛋白PI3K、AKT、ERK、MEK、GSK-3β、p-catenin及磷酸化蛋白P-P13K、P-AKT、 P-ERK、P-MEK、p-GSK-3p,肿瘤抑制因子PTEN,核转录因子c-myc、Snail、 Slug,上皮标志物E-cadherin及间质标志物vimentin、N-cadherin,基质金属蛋白酶MMPs的表达变化。初步探讨FAP参与口腔鳞癌细胞EMT的信号通路。结果：1.FAP在口腔鳞癌组织中的表达及其临床意义成纤维细胞活化蛋白在84例口腔鳞状细胞癌组织中的低表达为31/84(36.9%)、高表达为53/84(63.1%),显著高于12例正常组织的低表达11/12(91.7%),(P=0.0001)；成纤维细胞活化蛋白在口腔鳞癌临床分期Ⅲ-ca期中的表达显著高于Ⅰ～Ⅱ期中的表达(P=0.0001)；原发肿瘤大小(T分期)显示T3-T4患者的表达显著高于T1-T2的患者(P=0.027)；淋巴结转移分期(N分期)提示N2-N3患者表达显著高于N0-N1的患者(P=0.015)；远处转移(M分期)提示有远处转移(M1)患者的表达与无远处转移(M0)的差异不大(P<0.391),以上结果提示中晚期癌的表达显著高于早期癌。而其与性别(P=0.645)、年龄(P=0.813)、是否吸烟(P=0.267)、是否酗酒(P=0.331)、嚼食槟榔、肿瘤原发部位(P=0.955)以及是否复发(P=0.795)关联性不大。生存分析曲线提示FAP的表达与口腔鳞癌患者的总生存时间相关。以上结果提示FAP可能与口腔鳞癌的发生、发展以及EMT相关。细胞免疫荧光显示FAP在口腔鳞癌细胞株的表达主要定位在胞膜和胞浆。2.FAP沉默对口腔鳞癌细胞EMT的影响构建慢病毒稳定干扰细胞株的同时瞬时干扰KB细胞,经Western bolt和R-TPCR检测稳定干扰和瞬时干扰的效率都达75%以上,可用于后继实验。FAP沉默后,TRITC-鬼笔环肽检测口腔鳞癌细胞形态学改变,发现由梭形、类似于成纤维细胞的形态变成的典型的圆形或卵圆形；稳定干扰和瞬时干扰的Transwell小室实验、划痕实验、细胞粘附性实验、裸鼠成瘤肝转移模型均显示FAP沉默后细胞的侵袭、迁移运动和转移能力显著减弱(P<0.05)。以上结果提示内源性的FAP能促使结口腔鳞癌细胞发生EMT。3.FAP对口腔鳞癌细胞中EMT相关信号通路的调控作用FAP沉默后Western bolt检测发现EMT相关信号分子PI3K、AKT、ERK、 MEK、GSK-3p无变化但是其磷酸化蛋白P-PI3K、P-AKT、P-ERK、P-MEK、 P-GSK-3β、 p-catenin表达均下调,与转移相关的抑癌基因PTEN上调,核转录因子Snail、c-myc、Slug表达量均下调,上皮标志物E-cadherin上调,间质标志物vimentin、N-cadherin下调,基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9下调。提示FAP通过PTEN/PI3K/AKT和Ras/MEK/ERK两条信号通路途径促进结口腔鳞癌细胞发生EMT。结论1.FAP与口腔鳞癌细胞的EMT相关。2.FAP可能通过PI3K/AKT和Ras/MEK/ERK两条信号通路促进口腔鳞癌细胞发生EMT促进口腔鳞癌细胞转移。本研究的创新之处：1.首次发现口腔鳞癌细胞中表达FAP；2.首次阐明FAP参与口腔鳞癌细胞EMT的作用机制；3.为口腔鳞癌转移机制的研究提供了新的靶标,为进一步研究FAP并应用于诊断、治疗、判断预后提供基础。