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木糖的利用效率是影响秸秆乙醇综合成本的重要因素之一。传统工业酿酒酵母由于缺少把木糖转化为木酮糖的专一酶系而不能代谢木糖。如果把转化木糖为木酮糖的酶系引入工业酿酒酵母,将会推进和加快秸秆乙醇生产技术的实用化进程。本文通过异源基因表达出木糖异构酶的方式,改造工业酿酒酵母利用木糖的途径。几乎在所有测试条件下,利用木糖异构酶途径的菌株相比于利用木糖代谢另一种氧化还原途径的菌株都具有更好的产量。D-木糖被木糖异构酶催化产生D-木酮糖之后,为完善木糖代谢的下游酶系,需要超表达木酮糖激酶。酿酒酵母的基因组虽然包含了编码木酮糖激酶的基因XKS1,但其活性太低,无法满足导入木糖代谢途径工程菌发酵木糖生成乙醇的需要。超表达木酮糖激酶使木糖的代谢更多的流向乙醇。木糖醇是酵母木糖代谢产乙醇的主要副产物之一,GRE3基因编码的内源性醛糖还原酶就是把木糖还原成木糖醇的酶,而木糖醇还会抑制木糖异构酶的活性。先从毕赤酵母基因组上获得组成型翻译延伸因子-1(TEF-1)启动子,通过酶切连接的方式连接到从工业酿酒酵母组中获得的木酮糖激酶(XK)测序质粒上。再通过Clontech的In-Fusion的无缝连接技术把带有翻译延伸因子-1(TEF-1)启动子的木酮糖激酶(XK)连接到拥有尿嘧啶缺陷型筛选因子的穿梭质粒p YES2-XI质粒上,从而成功构建穿梭质粒p YES2-XI-TEF1-XK。虽还未成功转化进入T1308工业酿酒酵母并表达,但为以后转化进入T1308工业酿酒酵母打下基础,从而观察木糖代谢能力是否有显著提高做了前期工作。为减少副产物的毒害作用,本文将以性能优异的工业酵母T1308为出发菌株,分别构建敲除1个GRE3基因的1308-GRE3Δ1和敲除2个GRE3基因的菌株1308-GRE3Δ2。经实验证实,工程菌株1308-GRE3Δ1能够提高木糖发酵乙醇的效率,副产物木糖醇相比出发菌株降低了75.1%。而且,工程菌株1308-GRE3Δ1还具有不影响原有的葡萄糖利用率和对抑制物耐受力高等优点。