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目的:体外培养、扩增和纯化沙眼衣原体鼠肺炎株(MoPn)。比较几种转化MoPn菌株在体外培养中对宿主细胞的感染力,鉴定与衣原体质粒侵袭细胞相关的毒力基因,并比较不同实验条件对衣原体侵袭和粘附宿主细胞能力的影响;鉴定影响衣原体在宿主细胞与细胞间传播和生长能力和导致包涵体内糖原合成障碍相关的基因。方法:选取Hela细胞为宿主细胞,将携带敲除了衣原体质粒中不同开放阅读框(ORF)的各转化菌株接种培养20~24h,复苏成功后不断扩增收集。采用泛影钠-泛影葡胺密度梯度离心法进行菌株的纯化;测定各菌株浓度,按相同的菌量接种,设定离心+二乙胺乙基葡聚糖(DEAE-D)、离心、DEAE-D、无任何处理四个接种条件,在不同的实验条件下分别对各菌株进行处理,利用间接免疫荧光显微镜计数包涵体数目;分别于(20、40、60 h)观察各菌株连续3代感染细胞后菌斑形成的速度与面积大小;采用Lugol碘液染色,在倒置显微镜下,观察各菌株包涵体内糖原的合成情况。结果:纯化后获得了高感染活性的沙眼衣原体原体(EB)。敲除质粒编码蛋白Pgp4的菌株p GFP::CMΔPgp4在4种条件下包涵体数目分别为(10.20±1.30)、(6.80±0.44)、(3.00±1.22)和(0.80±0.45)个,阴性对照组质粒缺失株CMUT3包涵体数目分别为(6.40±0.89)、(3.80±0.83)、(1.60±0.89)和(0.60±0.54)个,同一条件下两者均表现出相近的感染能力,包涵体数目均低于同一条件下其他菌株(均P<0.01);同一菌株在不同条件下,包涵体数目差异具有统计学意义(F=845.310,P<0.01);各菌株在离心+DEAE-D条件下包涵体数目最多;菌株p GFP::CMΔPgp4和质粒缺失株连续3代感染细胞时菌斑形成的速度和面积大小均低于其他菌株;并出现糖原累积的障碍。结论:超速低温密度梯度离心纯化能够去除细胞中其它细胞成分对实验结果的影响,较既往常规的纯化方法更能保证结果的可靠性。Pgp4是衣原体质粒侵袭细胞相关的毒力基因之一,影响衣原体在宿主细胞与细胞之间的传播和生长能力和包涵体内糖原的合成能力。实验条件离心和DEAE-D均能增强毒力基因在体外对宿主细胞的侵袭和粘附能力。