植物的自交不亲和性（self-incompatibility,SI）在植物界中普遍存在,是植物为了防止近亲繁殖、促进物种分化、保持遗传多样性,而在长期进化过程中形成的一种复杂而完善的重要机制。它实质上是一种雌蕊识别自体花粉和异体花粉,阻止自体花粉萌发的信号传导过程,涉及从授粉到受精过程中发生的花粉和雌蕊之间的相互作用,几乎一半以上的显花植物具有自交不亲和性,涉及到70多个科、250多个属。甘蓝是典型的具有孢子体型自交不亲和性的芸薹属植物,这类SI在遗传上受一个带有复等位基因的多态性S基因座所控制。最近几年,对芸薹属自交不亲和性的决定性因子研究方面,取得了长足的进步。迄今为止,已分离到3类与S位点连锁的基因,分别编码SLG（S-locusglycoprotein,S位点糖蛋白）、S位点富半胱氨酸蛋白SCR（S-locus cystein-rich protein）/SPll（S-locus protein 11,S位点蛋白11）和SRK（S-locus receptor kinase,S位点受体激酶）。三个基因（SLG、SRK、SCR）的相继分离与鉴定,意味着由SRK介导的自交不亲和信号传导的上游事件越来越清晰了。来自花粉中的SCR/SP11在SLG的协助下与柱头上的跨膜蛋白SRK的胞外域相互识别,当两者具有相同单倍型时,SRK发生自我磷酸化,引起细胞内信号的级联反应,最后抑制自花花粉的萌发、水合或花粉管伸长。但是,对SRK介导的细胞信号传导下游磷酸化蛋白研究相对于上游受体来说要缓慢得多。在整个信号传导途径中,ARC1是下游事件中最为感兴趣的蛋白之一,它能够与SRK相互作用,并将信号传递给下游因子。因此在自交不亲和信号传导过程,SRK与ARC1的结合与否以及复合体的存在和变化是证实这个分子过程和调控自交不亲和反应的关键。为了探索这些问题,必须首先鉴定ARC1与SRK之间的相互作用,调控二者的解离与聚合,深入分析二者的作用机理,建立相互作用化控试剂的筛选平台,从而为下一步筛选ARC1的下游因子创造条件。本研究以高度自交不亲和性甘蓝E1为材料,克隆了自交不亲和信号传导元件ARC1和SRK基因,并进行了表达分析。体外证实了ARC1与SRK的相互作用,建立了适用于SRK和ARC1相互作用的体外检测体系,为进一步的化学调控试剂的筛选,实现SRK-ARC1复合体聚合与解离的人为调控提供理论和技术基础。主要工作及结果总结如下:1甘蓝ARC1臂重复蛋白编码基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达1.1 ARC1基因的克隆与序列分析采用PCR和RT-PCR技术,以甘蓝E1基因组DNA和柱头总RNA为模板,扩增了ARC1的DNA和cDNA序列,经测序和序列分析表明,DNA序列无内含子存在,扩增ARC1基因的编码序列为1 992 bp,编码663个氨基酸残基,分子量为73.5 kD。序列同源性分析表明,甘蓝E1的ARC1基因（B.oleracea E1 ARC1）与羽衣甘蓝ARC1基因（B.oleracea kale ARC1,NCBI登录号:EU344909）、油菜ARC1基因（B.napus ARC1,NCBI登录号:AF024625）、甘蓝20010197 ARC1基因(B.oleracea ARC1 20010197^[188])、甘蓝ARC1基因（B.oleracea ARC1,NCBI登录号:AJ417335）、拟南芥中泛素蛋白连接酶（A.thaliana PUB17,NCBI登录号:NM102674）、水芹ARC1基因（A.thaliana cress ARC1,NCBI登录号:AY150512）的同源性分别为97%、94%、93%、95%、70%和70%。作为芸薹属5个基因,B.oleracea E1 ARC1、B.oleracea kale ARC1、B.oleracea ARC1 20010197、B.oleracea ARC1、B.napus ARC1之间的碱基差异很小,而作为十字花科中不同属的两个基因B.oleracea E1 ARC1和A.thaliana ARC1,在碱基上却存在相对较大的差异,编码的碱基差异大多数集中在ARC1的N端,说明ARC1基因存在较强的保守性,而且C端区域的保守性强于N端。在甘蓝与油菜的序列中均存在碱基的缺失,但这种缺失往往是以密码子形式的缺失,并没有引起移码突变。同源氨基酸序列进行比对显示,B.oleracea E1 ARC1基因编码的氨基酸序列与B.oleracea kale ARC1、B.oleraceaARC1 20010197、B.napus ARC1、A.thaliana ARC1所编码的氨基酸序列相似性分别为97.9%、97.6%、93.2%和53.2%。建立进化树后分析发现,B.oleracea E1 ARC1与B.oleracea kale ARC1、B.oleracea ARC1 20010197、B.oleracea ARC1的亲缘关系较近,而与B.napus ARC1、A.thalianaPUB17、A.thaliana cress ARC1的亲缘关系较远,更充分说明了ARC1基因的较强保守性,而且种间的保守性高于属间的保守性。在甘蓝E1的ARC1蛋白质序列中有一个U-box结构,5个臂重复序列。U-box结构位于第282个氨基酸和第347个氨基酸之间,臂重复序列编码42个氨基酸残基,油菜ARC1的U-box结构位于第283个氨基酸和第347个氨基酸之间。而在拟南芥中臂重复序列只有1个,这种较大的差异可能是导致ARC1作为与自交不亲和信号传导有关的基因在两个不同属之间的功能有所不同的原因。对甘蓝E1的ARC1蛋白的活性位点分析发现,ARC1蛋白中具有犰狳的ARM活性位点,该位点在芸薹属中的保守性很差,同时还发现其它磷酸化活性位点,包括10个蛋白激酶C磷酸化位点、1个亮氨酸拉链位点、2个基于cAMP-和cGMP蛋白激酶林磷酸化位点、11个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、5个N-糖基化位点、8个N-肉豆蔻酰化位点、1个氨基化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点,这些位点的存在与ARC1蛋白参与信号传导过程中依赖的磷酸化作用是相辅相成的。另外,拉链结构的存在,可能与ARC1的二聚化有关,或者是下一级信号传导元件的结合位点。ARC1蛋白的三维图形覆盖了400个氨基酸（第264位到第663位氨基酸）,该段蛋白的结构整体上是右手螺旋,形成了类似海马状构型,腹部中空,形成大沟,背部形成小沟,小沟区域正是ARM结构域,可能为它与其他蛋白的结合提供了相应位点。1.2 ARC1在大肠杆菌中的表达提取pMD18-T-ARC1和pET43.1a质粒,经EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切,纯化回收ARC1和pET43.1a片段,用T4 DNA Ligase连接以构建表达质粒pET43.1a-ARC1,经PCR以及EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定。提取pET43.1a-ARC1质粒,转化表达宿主菌BL21,IPTG诱导表达ARC1融合蛋白,表达产物的SDS-PAGE结果显示,在约135 kD处有重组蛋白表达特异带出现,其蛋白质相对分子质量与预计值相符。在诱导的过程中,IPTG浓度影响不大,但诱导温度（℃）对ARC1蛋白的表达影响很大,最佳诱导条件为:温度32℃;IPTG 1.0 mmol·L;时间4 h。诱导表达的融合蛋白ARC1主要是以包涵体的形式存在,但通过细胞破碎及蛋白纯化试剂盒纯化后,纯化产物经SDS-PAGE检测,泳道基本没有杂蛋白条带,纯化结果比较理想。2甘蓝SRK激酶结构域编码序列的克隆与其在大肠杆菌中的表达2.1 SRK_K1基因的克隆与序列分析以甘蓝E1为材料,特异扩增SRK激酶结构域编码区序列(SRK_E1)。测序结果显示扩增的DNA序列和cDNA序列分别为1 711 bp和1 241 bp,DNA序列包含6个外显子、5个内含子,内含子大小分别为89 bp、107 bp、89bp、102 bp和78 bp。5个内含子的5’和3’端完全符合经典的GT-AG法则。同源氨基酸序列比对表明,SRK_E1与sRK₆、SRK₉₁₀、SRK₁₈、SRK₂₉氨基酸序列同源性分别为88.2%、85.7%、87.2%和85.7%。SRK_E1的氨基酸序列包含了跨膜结构域的后16个氨基酸和整个激酶结构域,跨膜结构域的Cys和激酶活性位点Lys并没有发生突变。用Blastp程序对SRK_E1的氨基酸序列进行保守结构域分析发现,该序列中存在蛋白激酶结构域和酪氨酸激酶结构域。蛋白激酶结构域位于第78位氨基酸和第361位氨基酸之间,编码284个氨基酸。在系统进化分析中发现,不同单元型SRK依据序列同源性高低分为两类（ClassⅠ和ClassⅡ）,ClassⅠ表现为高度自交不亲和,ClassⅡ(SRK₁₅、SRK₆₀、SRK₂、SRK₂₉和SRK₅)的自交不亲和性较弱,SRK_E1与SRK₄₅、SRK₃聚类在一起。因此,依据不同单元型SRK序列的多态性从分子层面上证明了E1材料的高度自交不亲和性。2.2 SRK_E1在大肠杆菌中的表达提取pMD18-T-SRK_E1和pET43.1a质粒,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切,纯化回收SRK_E1和pET43.1a片段,用T4 DNA Ligase连接以构建表达质粒pET43.1a-SRK_E1,经PCR以及BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定。提取pET43.1a-SRK_E1质粒,转化表达宿主菌BL21,IPTG诱导表达SRK_E1融合蛋白,表达产物的SDS-PAGE结果显示,在约107 kD处有重组蛋白表达特异带出现,IPTG的浓度和诱导温度对该蛋白表达量的影响不大,且表达的SRK_E1融合蛋白主要包涵体形式存在。SRK_E1融合蛋白最佳的诱导表达条件为:温度37℃;IPTG 0.5 mmol·L^-1;时间4h。3 ARC1与SRK_E1体外相互作用的方法建立免疫共沉淀法鉴定蛋白质相互作用原理表明,蛋白质X与蛋白质Y相互作用,如蛋白质X与其抗体免疫沉淀,则蛋白Y会与蛋白质X及其抗体一起沉淀下来。依据该原理利用pET43.1a作为表达载体表达ARC1、SRK_E1,巧妙利用了pET43.1a-ARC1、pET43.1a-SRK_E1融合蛋白序列中的6×His标签与Ni⁺相结合的特点,探索性地建立了体外检测蛋白质间相互作用的新方法。将pET43.1a-SRK_E1融合蛋白与Ni⁺结合,结合后的复合物作为“诱饵蛋白”,把体外表达的ARC1融合蛋白溶于适于相互作用的缓冲液中作为“靶蛋白”溶液,两者4℃条件下孵育后利用pET43.1a-SRK_E1上结合的Ni⁺与磁力架吸附性将“诱饵蛋白”与靶蛋白的复合体纯化出来。本研究对ARC1与SRK_E1相互作用的检测,条带清楚,明确证实了两者相互作用,得到了理想的结果,说明我们建立的体外检测蛋白相互作用方法是可行的。本方法与免疫共沉淀法鉴定蛋白质相互作用相比,不需要制备抗体,简化了实验操作,避免了因抗体特异性不强可能带来的假阳性结果。另外本文建立的检测体系可作为ARC1与SRK相互作用的化控试剂筛选平台,从而为深入分析两者相互作用的机理以及分离和鉴定自交不亲和未知的下游信号传导元件提供新的信息与线索。4 ARC1与SRK_E1相互作用的体外检测将在大肠杆菌BL21中诱导表达的pET43.1a-SRK_E1融合蛋白Ni⁺结合,结合后的复合物作为“诱饵蛋白”。将在大肠杆菌BL21中诱导表达的pET43.1a-ARC1融合蛋白作为“靶蛋白”,并溶解在适于相互作用的缓冲液中,“诱饵蛋白”和“靶蛋白”溶液在4℃条件下孵育2 h,每隔15 min轻轻翻转混匀一次,然后利用pET43.1a-SRK_E1融合蛋白结合的Ni⁺与磁力架吸附性将诱饵蛋白和蛋白的复合体纯化出来,产物经SDS-PAGE检测,结果表明ARC1蛋白与SRK_E1蛋白在体外能够相互结合,可能形成稳定的复合体,同时也说明二者的相互作用并非产生于瞬间的结合。