目前，古菌日益引起了科学工作者的广泛关注。它代表了所有最原始生物形态的分枝，在所有的生命形态中，古菌最接近生命的原始形态。古菌的发现改变了传统生物分类的界限，提供了一种研究生物进化及生命起源的新方法。研究表明，古菌在DNA复制、转录、翻译等方面与真核生物相似；而在中央代谢(如产能)方面则与细菌接近。因此，研究古菌不仅在阐明生命运动的基本规律、物种进化等方面具有重大意义，而且有助于了解较为复杂的真核生物的一些重要生物学过程。 本文以超嗜热古菌PyrococcushorikoshiiOT3为研究对象，根据其遗传信息，通过生物信息学方法进行分析，预测Pyrococcushorikoshii中的PHS051基因能够表达一种具有组蛋白生物学功能的蛋白质。由于组蛋白在进化上十分保守，故其成为研究分子进化的很好的材料。通过对嗜热古菌组蛋白与大肠杆菌组蛋白以及真核组蛋白H4作以同源序列比较分析，发现古菌组蛋白一级结构及三级结构的保守性，其中保守序列ELPIAP是一个新的蛋白质域，而且仅仅存在于古菌中。 首先进行古菌的小量培养，从中提取染色体DNA，通过常规PCR反应，钓取PHS051基因，将这段目的基因重组到质粒pET11a中，经酶切鉴定及序列测定证实目的基因已经成功的插入到质粒pET11a中。将重组质粒转化至感受态细胞E.coliBL21-CodonPlus中，构建表达古菌组蛋白HPhA的工程菌。但是，已构建的组蛋白工程菌表达率较低，经研究发现嗜热古菌组蛋白基因序列中精氨酸密码子为AGG或AGA，在大肠杆菌中的表达率极低，而组蛋白中含有5个精氨酸，因此可以肯定精氨酸密码子是表达率低的主要原因之一。由于精氨酸在古菌组蛋白中分散存在，我们在传统PCR定点突变技术的基础上进行了改进，参照嗜热菌组蛋白基因序列和大肠杆菌偏爱密码子表，设计了一对含有5个精氨酸突变密码子的单链DNA，全长为115nt，在3’端有20nt互补序列。将单链DNA在94℃变性，45℃复性，使其互补结合，72℃进行延伸反应，得到含有突变位点的组蛋白基因；再以此基因为模板设计相应的一对引物进行PCR扩增反应，得到大量组蛋白突变基因。将突变基因克隆至表达载体pET11a，并转化到宿主菌中，进行重组蛋白HPhA的表达，表达量提高约2.7倍。 工程菌在37℃条件下进行培养，IPTG诱导后降温至25℃过夜培养，所得到的菌体经过超声波破碎、热变性、PD-10柱层析及肝素亲合柱层析得到HPhA纯品。经Tricine-SDS-PAGE电泳和高效液相色谱检测表明其纯度在90％以上；激光解析电离飞行时间质谱对重组蛋白HPhA的分子量进行了检测，结果为7860.9Da，与根据氨基酸序列计算的理论值7868.3Da基本一致；等电聚焦实验表明HPhA的等电点约为9.07；利用酸水解法对重组蛋白HPhA的氨基酸组成进行分析，结果与理论值基本一致。 在确定了重组蛋白HPhA理化性质的基础上，又对HPhA的生物学活性进行研究。HPhA能够和DNA结合，形成HPhA-DNA复合物。通过凝胶迁移率变动分析实验，证明重组蛋白HPhA具有提高线形DNA在凝胶电泳中迁移率的作用。HPhA与DNA不同的质量比，表现出的迁移率是不同的。重组蛋白HPhA基因来源于嗜热古菌，因此具有很强的耐热性。实验表明，HPhA具有耐高温的特性。特别在高盐条件下(1mol/LKCl)，HPhA在95℃条件下保温16小时，仍然保持与DNA结合的活性。重组蛋白HPhA对DNA具有一定的的保护作用，具体表现为在适宜的HPhA浓度下，可以降低限制性内切酶TaqⅠ对DNA的降解。另外，研究表明HPhA对线形DNA的Tm值产生影响，可以提高线形DNA的Tm值约20℃。将组蛋白HPhA与嗜热性古细菌组蛋白HMfB和嗜中温古菌组蛋白HFoB比较后，分析了组蛋白HPhA特殊的耐热性，发现并不主要在于其总体的三维结构，而是由于非保守序列的微小差异导致热稳定性的较大差异。HPhA中含有大量的丙氨酸、多电荷残基、芳香类残基和疏水性残基，这些都是HPhA具有极强的耐热性必不可少的因素。目前正在对HPhA的晶体结构进行研究，将提供新的实验数据，并对其耐热机制提出更加合理的解释。 基因治疗是从20世纪80年代发展起来的最具革命性的医疗技术。近十年来，它作为一项全新的疾病治疗手段已经显现出强大的发展势头。“人类基因组计划”的实施以及所取得的成果，不仅使人类更加清楚地了解自身，而且为基因诊断和基因治疗的研究、开发与产业化奠定了基础。但是，基因治疗也存在一些问题，特别是基因载体技术严重限制了基因治疗的发展。组蛋白作为DNA结合蛋白，有可能成为一种有效的基因载体。 因为重组蛋白HPhA具有与组蛋白相同的功能，而且稳定性也较好，有可能作为外源基因的载体。通过实验证实，HPhA能够与表达质粒稳定的结合，形成复合物，而且可以有效的降低脱氧核糖核酸酶对外源表达质粒的降解，起到很好的保护作用。通过体外细胞转染实验，确定了HPhA作为基因载体介导转染的最佳方案。为得到最高的转染效率，重组蛋白HPhA与外源表达质粒的质量比为6∶1，复合物与被转染靶细胞的作用时间为4小时。转染体系中需加入2mM的CaCl2，这一因素对转染效率影响较大。HPhA介导的转染能够有效的克服血清对转染的影响，而且可以介导转染不同的靶细胞，表明HPhA的应用具有广泛性。与商品Lipofectamine介导的转染相比较，HPhA介导的转染效率稍低，但HPhA对细胞的毒性要远远低于Lipofectamine。这对于今后体内的基因转染是极为关键的。在此基础上，对重组蛋白HPhA介导的体内基因转染进行了初步的研究。首先构建了含有乙型肝炎表面抗原基因序列的重组质粒pcDNAHBs，然后以COS7为靶细胞进行体外瞬时表达实验，证实了HPhA介导的细胞转染显著提高了转染的效率；在体内转染实验中，用HPhA-DNA复合物对小鼠进行骨骼肌免疫，在14天后，检测到抗体呈阳性反应，并且抗体表达量逐渐增加，在第9周达到最高峰2937miU/ml，且抗体持续表达至少达到18周。但始终未在免疫小鼠血清中检测到抗原。实验表明重组蛋白HPhA可以作为基因载体进行体内转染，并且效果明显优于裸DNA的转染效率，具有很好的应用前景。HPhA的应用可能为基因治疗存在的一些问题提供新的解决途径。 通过对重组蛋白HPhA的研究，不仅为嗜热古核菌组蛋白家族又添了一个新成员，而且为极端菌的研究和应用提供了一个成功的范例。HPhA特殊的结构有可能为改进蛋白质的稳定性和耐热性提供一定的帮助。最为重要的是嗜热古核菌重组蛋白HPhA既保持了真核生物组蛋白的基本二级及三级结构，而且其分子量小、稳定性好、DNA结合及组装能力强，有希望成为一种新颖、应用广泛及高效的基因载体。