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在真核生物细胞中,线粒体细胞器扮演着非常关键的角色,主要负责给细胞提供能量。线粒体功能紊乱会引发线粒体疾病,所以探索研究线粒体代谢机制及线粒体蛋白对代谢机制的影响至关重要。最近研究发现,在线粒体中存在一种新的脂肪酸合成通路,与这种通路相关的酶获得了广泛地关注。在线粒体脂肪酸合成酶中,由17β-羟基类固醇脱氢酶8(17β-HSD8)和羰基还原酶4(CBR4)组成的3-酮脂酰-酰基载体蛋白还原酶(KAR)发现较晚,其亚基的组装机理依然有待研究。本文对17β-HSD8和CBR4这两种蛋白的组装机理进行了探索研究,主要如下:l)利用大肠杆菌表达体系,分别表达提纯Hs17β-HSD8和HsCBR4蛋白。已有研究表明,Hs17β-HSD8和HsCBR4在大肠杆菌体内过量表达时,主要以包涵体的形式存在。为了提高蛋白可溶性表达,我们采用了降低蛋白表达温度以及引入伴侣蛋白系统的方式。通过比较不同温度下可溶蛋白表达情况,并参考前人研究,选择18℃作为表达温度。在此基础上,我们引入伴侣蛋白系统:dnaK、dnaJ、grpE、groEL、groES和trigger factor,通过可溶性含量分析,选择出效果最优的伴侣组合groEL-groES,最终我们成功地分别表达提纯获得Hs17β-HSD8和HsCBR4酶。2)Hs17β-HSD8和HsCBR4蛋白在生理缓冲溶液和细胞破碎液中组装。将提纯获得的Hs17β-HSD8和HsCBR4蛋白置于4℃组装,约60 h组装达到平衡,组装速率缓慢。为了进一步探索影响这两种蛋白组装的因素,我们尝试了在细胞破碎液中进行组装研究。结果显示,在细胞提取液中,Hs17β-HSD8和HsCBR4蛋白短时间内便会迅速完成组装,证明细胞中存在一些未知的因素能够促进这两种蛋白组装。3)利用双分子荧光互补实验(BiFC)研究Hs17β-HSD8和HsCBR4在大肠杆菌细胞内的相互作用。我们选用了m Cherry这一特征波长较长的红色荧光蛋白构建荧光互补系统。首先将m Cherry蛋白从氨基酸159/160位点切分成两部分,通过基因融合的方式分别与HsCBR4和Hs17β-HSD8相连,然后转入大肠杆菌进行表达,最后用荧光显微镜表征。实验结果证实这两种蛋白在大肠杆菌细胞内相互靠近,以共聚物的形式存在。