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第一部分 CHOP对主动脉瓣膜钙化的影响目的:明确CHOP在主动脉瓣膜钙化中的作用,并进一步探索CHOP对主动脉瓣膜钙化的作用机制。方法:临床收集钙化主动脉瓣膜和正常主动脉瓣膜,von kossa染色检测钙结节沉积,免疫组织化学、Western blot和q RT-PCR检测CHOP的表达水平,Western blot和q RT-PCR检测钙化标志蛋白Runx2的表达水平。通过对Apoe-/-小鼠进一步敲除CHOP基因进行研究,构建Apoe-/-CHOP-/-小鼠,与Apoe-/-小鼠进行对比,每组各10例,均进行24周西方饮食诱导后,小鼠超声心动图检测心功能、主动脉跨瓣峰流速等指标,von kossa染色检测主动脉瓣膜钙化结节的形成,ELISA检测小鼠甘油三酯、总胆固醇、血糖、血钙和血磷等生化指标;TUNEL染色检测小鼠主动脉瓣膜凋亡程度,免疫荧光检测caspase-3和CD68的表达,q RT-PCR检测小鼠主动脉瓣膜钙化标志蛋白Runx2、osteocalcin和ALP的表达水平。采用独立样本t检验,认为P<0.05具有统计学意义。结果:钙化主动脉瓣膜中有大量钙结节沉积,免疫组织化学和Western blot均显示CHOP表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05);Western blot和q RT-PCR结果显示Runx2的表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光显示Apoe-/-CHOP-/-小鼠主动脉瓣膜中CHOP表达缺失,构建动物双敲模型成功;经24周西方饮食之后,与Apoe-/-小鼠相比,Apoe-/-CHOP-/-小鼠主动脉瓣膜跨瓣峰血流降低、瓣膜小叶厚度下降、主动脉瓣膜钙结节沉积减少,差异均具有统计学意义(P值均<0.05);而两组小鼠左心室功能、血糖、血脂、钙磷代谢等均无差异。同时,Apoe-/-CHOP-/-小鼠较Apoe-/-小鼠的主动脉瓣膜凋亡减轻,caspase-3表达减少,Runx2、osteocalcin和ALP的表达水平下降,差异均具有统计学意义(P值均<0.05)。结论:钙化主动脉瓣膜中CHOP表达升高,敲除CHOP基因后可缓解主动脉瓣膜钙化,抑制凋亡和抑制促钙化信号的激活,且该效应不通过改变血糖、血脂、钙磷代谢等途径起作用。第二部分 CHOP对瓣膜间质细胞钙化的影响及其机制研究目的:探讨CHOP对主动脉瓣膜间质细胞(AVIC)钙化的影响及其分子生物学机制。方法:收集急性主动脉夹层进行Bentall手术或扩张性心肌病行心脏移植患者的主动脉瓣膜,采用胶原酶消化法提取AVIC。采用si RNA和慢病毒sh RNA转染氧化低密度脂蛋白(ox LDL)干预和未干预的AVIC,Western blot检测CHOP、Runx2、ALP的表达水平,流式细胞仪检测ALP的活性,茜素红染色检测AVIC的钙沉积程度;为评估凋亡水平,通过Western blot检测caspase-3的表达,流式细胞仪检测AVIC的凋亡程度。并进一步提取上述各组细胞培养的上清液作为条件培养基对AVIC进行培养,通过上述相同的方法检测CHOP、Runx2、ALP的表达水平以及ALP的活性,并检测AVIC钙沉积的程度,以明确CHOP是否通过参与旁分泌途径影响AVIC的成骨分化。进一步去除ox LDL+抑制CHOP和仅ox LDL诱导产生的条件培养基中的凋亡小体(ABs),分别培养AVIC,通过上述相同的方法检测CHOP、Runx2、ALP的表达水平以及ALP的活性,并检测AVIC钙结节沉积,以明确ABs在ox LDL/CHOP信号通路中对AVIC成骨分化产生的作用及机制。两组样本之间确定统计学差异采用独立样本t检验,多组数据之间采用单因素方差分析或卡方检验。认为P<0.05具有统计学意义。结果:在AVIC中,ox LDL促进CHOP的表达,同时Runx2和ALP的表达升高,ALP的活性升高,钙结节沉积增加(P值均<0.05);抑制CHOP后,上述所有变化程度均减弱(P值均<0.05)。ox LDL促进AVIC的凋亡,经ox LDL干预后,AVIC凋亡增多,caspase-3表达增加;上述改变在抑制CHOP后均得到缓解(P值均<0.05)。通过条件培养基,同样发现ox LDL干预后制备的条件培养基能促进Runx2和ALP的表达、ALP的活性以及钙结节沉积(P值均<0.05),ox LDL+抑制CHOP制备的条件培养基减弱了上述改变(P值均<0.05),说明CHOP参与了ox LDL对AVIC的促钙化进程,这一进程部分是通过参与旁分泌途径实现的。进一步去除条件培养基中的ABs,发现在CHOP不变的前提下,Runx2和ALP的表达、ALP的活性以及钙结节沉积程度均下降(P值均<0.05);在ox LDL+抑制CHOP制备的条件培养基中,未去除ABs时,与未抑制CHOP制备的条件培养基相比,Runx2和ALP的表达、ALP的活性以及钙结节沉积程度均下降(P值均<0.05),但这种变化在去除ABs后未进一步下降;同时,去除ABs后,ox LDL+抑制CHOP与ox LDL制备的条件培养基两组相比,Runx2和ALP的表达、ALP的活性以及钙结节沉积均无差异(P值均>0.05)。结论:ox LDL通过激活CHOP诱导AVIC的凋亡和成骨分化;抑制CHOP缓解ox LDL通过旁分泌诱导AVIC的成骨分化;ABs参与了ox LDL/CHOP诱导AVIC成骨分化。最终证实CHOP缺失通过抑制AVIC分泌的ABs,缓解了ox LDL通过旁分泌诱导AVIC的成骨分化。