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牛传染性胸膜肺炎(CBPP)是由丝状支原体丝状亚种(Mmm)引起的一种危害严重的接触性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为需要上报传染病。我国于2011年5月被世界动物卫生组织(OIE)宣布为无牛肺疫国家,为保持无疫状态我国每年都会按OIE要求在全国范围内开展CBPP血清学监测。在进行CBPP的血清学检测时,由于没有国产化的试剂盒,因此只能使用进口竞争ELISA(c ELISA)试剂盒开展检测。进口试剂盒其检测成本较高、供货期长,不能满足该病大规模监测及有效防控的要求。虽然我国目前未发现CBPP感染病例,但该病在我国周边国家仍存在流行,传入我国的风险很大。因此,本研究围绕CBPP的血清学诊断方法开展研究,以期为我国CBPP大规模监测提供经济有效的检测手段,也为CBPP传入我国的风险评估和应急防控提供有效技术储备。由于支原体没有细胞壁,其锚定于质膜胞外的表面脂蛋白与宿主直接相互作用,引发机体强烈的免疫反应。表面脂蛋白在支原体诊断和致病性方面都引起了极大的关注,已被报道具有诊断抗原的潜能。因此本实验室通过生物信息学分析,初步筛选到12个脂蛋白进行后续研究。利用原核表达系统获得各候选脂蛋白,通过初步ELISA检测和Western Blot分析,筛选到特异性和抗原性较好的rP0308。将纯化的rP0308作为包被抗原,通过优化反应条件和确定临界值建立基于rP0308的间接ELISA方法。通过试验确定ELISA的最适工作条件,结果显示抗原最佳包被浓度为2.5μg/mL;血清1:80稀释37℃作用1h;最佳封闭条件为1%的鱼明胶4℃封闭过夜;二抗最佳工作条件为酶标二抗1:5000稀释37℃作用45min;最佳显色时间是TMB37℃显色10min;阴阳性临界值为0.36。为进一步评价其性能,对该方法的敏感性、特异性、灵敏性、交叉反应性、重复性及与OIE推荐的检测试剂盒的符合率等进行了分析。结果显示:该方法的敏感性为92%,最低检出上限为1280倍;特异性为96%,与其他几种常见的牛源性呼吸道疾病的阳性血清无交叉反应。批内和批间变异系数分别为2.41%-6.03%和2.94%-6.59%,均小于10%,重复性较好。利用本方法和OIE推荐的竞争ELISA试剂盒分别对实验室保存的1648份临床样品进行检测,两种方法的总符合率为88.7%。组装试剂盒4℃密封保存8个月性能良好。上述结果表明,该方法的敏感性、特异性、重复性均良好,具有一定的应用前景,为进一步开发CBPP检测试剂盒提供实验室依据。