第一部分应用iTRAQ技术联合2D LC-MS/MS筛选儿童恶性血液病血清蛋白质标志物　　背景与目的:恶性血液病是儿童时期常见的恶性肿瘤，目前其诊断主要依靠骨髓或淋巴结穿刺活检，但因其损伤较大致使患儿依从性差;近年来随着合理规范化疗及治疗策略的不断创新，恶性血液病的预后有了很大改善，然而仍有一部分患儿难以达到完全缓解或复发，并且传统的化疗药物毒副作用大造成化疗相关性死亡率高，因此恶性血液病急需寻找非侵袭性和特异性的早期诊断标志物和治疗靶点。同位素标记的相对和绝对定量(iTRAQ)标记的二维液相色谱串联质谱(2DLC-MS/MS）联合生物信息分析软件系统(IPA)的使用，是寻找差异蛋白、筛选蛋白分子标志物的理想工具。本研究联合iTRAQ-2DLC-MS/MS与IPA技术筛选儿童恶性血液病的血清差异表达蛋白，探讨恶性血液病诊断、治疗的新靶点以及可能的发病机制。　　方法:　　1.分别收集儿童初治急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)、急性粒细胞白血病部分分化型(M2)、急性早幼粒细胞白血病(M3)、急性单核细胞白血病（M5）、B细胞性非霍奇金淋巴瘤（B-NHL），T细胞性非霍奇金淋巴瘤（T-NHL）血清各20例作为实验组，收集同期体检正常儿童血清20例作为对照组。等量混合各组血清标本，提取蛋白后应用多重亲和去除系统(MARS)去除血清中14种高丰度蛋白，超滤除盐后采用Bradford法测定总蛋白浓度。　　2.应用iTRAQ试剂标记经胰酶消化后的肽段，113标记正常儿童对照组，114标记B-ALL组，115标记T-ALL组，116标记M2组，117标记M3组，118标记M5组，119标记B-NHL组，121标记T-NHL组。将标记后的肽段混合，运用二维高效反相液相色谱进行分离，然后串联质谱对样品进行分析鉴定。　　3.根据所鉴定出蛋白质的iTRAQ相对定量值，通过对儿童恶性血液病各组与正常对照组的蛋白表达量分别进行比较，筛选出差异倍数在1.2倍以上（上调或下调）的差异蛋白。　　4.应用生物信息学软件IPA分别分析恶性血液病各组与正常对照组的差异表达蛋白，获得各组差异蛋白的生物功能以及参与的信号通路和蛋白间相互作用网络;查阅差异蛋白相关文献并根据IPA分析结果初步筛选出有意义的血清差异表达蛋白。　　5.采用ELISA双抗夹心法分别检测了50例B-ALL、20例T-ALL、20例M2、20例M3、20例M5、20例B-NHL、20例T-NHL和30例正常儿童对照组的血清LRG1、S100A8和SPARC表达水平，并计算其统计学意义来验证质谱的准确性，进一步筛选与儿童恶性血液病相关的生物标记物。　　结果:　　1.应用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术，比较儿童恶性血液病各组和对照组血清差异蛋白，筛查与恶性血液病相关的血清标志物。质谱鉴定总共得到534个非冗余蛋白质，以正常儿童对照组蛋白质作为对照，分别计算各组表达值与正常对照组比值，设定其比值＞1.2或＜0.8（即差异倍数＞1.2且P＜0.05）为明显上调或下调蛋白，即各组有意义的血清差异表达蛋白。　　2.儿童恶性血液病各组的差异蛋白及其相关信号通路与关联蛋白相互作用网络　　(1)B-ALL组的血清差异蛋白共有81个，其中上调20个，下调61个;经IPA软件分析显示这些差异蛋白主要分布在与细胞信号转导和交互(Cell-To-CellSignaling and Interaction)、组织发育(Tissue Development)、细胞运动(CellularMovement)、免疫细胞运输（Immune Cell Trafficking）、心血管疾病(Cardiovascular Disease)、血液系统的发育和功能(Hematological SystemDevelopment and Function)等相关的功能中;而参与的主要信号通路包括Acute Phase Response Signaling、 LXR/RXR Activation、Coagulation System、Intrinsic Prothrombin Activation Pathway、 Atherosclerosis Signaling以及Extrinsic Prothrombin Activation Pathway通路等;差异蛋白共参与4个主要的蛋白相互作用网络（参与网络的目的差异蛋白超过9个）。　　(2)T-ALL组的血清差异蛋白共有85个，其中上调43个，下调42个;经IPA软件分析显示这些差异蛋白主要分布在与Cell-To-Cell Signaling andInteraction、Tissue Development、Cellular Movement、Immune Cell Trafficking、Cardiovascular Disease、Hematological System Development and Function等相关的功能中;而参与的主要信号通路包括Acute Phase Response Signaling、LXR/RXR Activation、 Atherosclerosis Signaling、 Clathrin-mediatedEndocytosis Signaling、 Production of Nitric Oxide and Reactive OxygenSpecies in Macrophages、IL-12 Signaling and Production in Macrophages、Agranulocyte Adhesion and Diapedesis通路等;此外差异蛋白共参与6个主要的蛋白相互作用网络（参与网络的目的蛋白超过9个）。　　(3)M2组的血清差异蛋白共有91个，其中上调27个，下调64个;经IPA软件分析显示这些差异蛋白主要分布在与Cellular Movement、Immune CellTrafficking、 Cardiovascular Disease、Cell-To-Cell Signaling and Interaction、Tissue Development、Organismal Injury and Abnormalities、HematologicalSystem Development and Function、Hematological Disease等相关的功能中;而参与的主要信号通路包括LXR/RXR Activation、 Acute Phase Response Signaling、 Coagulation System、 Atherosclerosis Signaling、 Intrinsic ProthrombinActivation Pathway、 Clathrin-mediated EndocytosisSignaling、 IL-12 Signalingand Production in Macrophages、 Production of Nitric Oxide and ReactiveOxygen Species in Macrophages通路等;此外差异蛋白共参与5个主要的蛋白相互作用网络（参与网络的目的蛋白超过9个）。　　(4) M3组的血清差异蛋白共有83个，其中上调33个，下调50个;经IPA软件分析显示这些差异蛋白主要分布在与Cellular Movement、 Immune CellTrafficking、 Hematological System Development and Function、 Cell-To-CellSignaling and Interaction、 Tissue Development、 Cardiovascular Disease、Inflammatory Response等相关的功能中;而参与的主要信号通路包括LXR/RXR Activation、 Acute Phase Response Signaling、 AtherosclerosisSignaling、 Complement System、 Production of Nitric Oxide and ReactiveOxygen Species in Macrophages、 IL-12 Signaling and Production inMacrophages通路等;此外差异蛋白共参与5个主要的蛋白相互作用网络（参与网络的目的蛋白超过11个）。　　(5) M5组的血清差异蛋白共有84个，其中上调26个，下调58个;经IPA软件分析显示这些差异蛋白主要分布在与Cardiovascular Disease、 Cell-To-CellSignaling and Interaction、 Tissue Development、 Metabolic Disease、Hematological Disease、 Hematological System Development and Function、Organismal Functions、 Immune Cell Trafficking等相关的功能中;而参与的主要信号通路包括Acute Phase Response Signaling、 LXR/RXR Activation、Complement System、 Atherosclerosis Signaling、 CoagulationSystem、 IL-12Signaling and Production in Macrophages、 Production of Nitric Oxide andReactive Oxygen Species in Macrophages通路等;此外差异蛋白共参与5个主要的蛋白相互作用网络（参与网络的目的蛋白超过11个）。　　(6) B-NHL组的血清差异蛋白共有79个，其中上调34个，下调45个;经IPA软件分析显示这些差异蛋白主要分布在与Cell-To-Cell Signaling and Interaction、Tissue Development、 Metabolic Disease、 Cellular Movement、 Immune CellTrafficking、 Hematological System Development and Function等相关的功能中;而参与的主要信号通路包括Acute Phase Response Signaling、 LXR/RXRActivation、 Intrinsic Prothrombin Activation Pathway、 CoagulationSystem、 Extrinsic Prothrombin Activation Pathway、Atherosclerosis Signaling通路等;此外差异蛋白共参与4个主要的蛋白相互作用网络（参与网络的目的蛋白超过11个）。　　(7) T-NHL组的血清差异蛋白共有73个，其中上调45个，下调28个;经IPA软件分析显示这些差异蛋白主要分布在与Organismal Injury and Abnormalities、Metabolic Disease、 Cardiovascular Disease、 Cell-To-Cell Signaling andInteraction、Tissue Development、Cellular Movement、Hematological SystemDevelopment and Function、Immune Cell Trafficking等相关的功能中;而参与的主要信号通路包括Acute Phase Response Signaling、 LXR/RXR Activation、Atherosclerosis Signaling、Production of Nitric Oxide and Reactive OxygenSpecies in Macrophages、 Clathrin-mediated EndocytosisSignaling、 IL-12Signaling and Production in Macrophages通路等;此外差异蛋白共参与4个主要的蛋白相互作用网络（参与网络的目的蛋白超过11个）。　　3.ELISA检测结果显示血清LRG1、S100A8和SPARC蛋白的表达情况与iTRAQ结果一致。ELISA结果验证了LRG1和S100A8在儿童恶性血液病血清中表达上调;SPARC蛋白在儿童急性白血病(Acute Leukemia)血清中表达水平下调，而在儿童NHL血清中无变化。　　结论:　　1.本研究首次应用iTRAQ-2DLC-MS/MS联合IPA技术筛选儿童恶性血液病血清的蛋白分子标志物，具有较高的重复性和精确性，共鉴定到534个非冗余蛋白质。得到了大量可靠的差异蛋白质信息，B-ALL组的差异蛋白共有81个，其中上调20个，下调61个;T-ALL组的血清差异蛋白85个，其中上调43个，下调42个;M2组的血清差异蛋白91个，其中其中上调27个，下调64个;M3组的血清差异蛋白83个，其中上调33个，下调50个;M5组的血清差异蛋白84个，其中其中上调26个，下调58个;B-NHL组的血清差异蛋白79个，其中上调34个，下调45个;T-NHL组的血清差异蛋白73个，其中上调45个，下调28个;为儿童恶性血液病早期诊断提供非侵袭性的手段及治疗提供潜在的靶点，并为进一步研究儿童恶性血液病可能的发病分子机制提供实验基础。　　2.采用IPA生物信息学方法对差异表达蛋白质的生物学功能及其涉及的信号通路进行分析，功能分析发现差异蛋白主要集中于细胞间信号转导与相互作用、血液系统的发育和功能、组织发育、细胞运动、免疫细胞运输等;进行IPA通路分析，发现大部分差异蛋白集中于Acute Phase Response Signaling、LXR/RXR Activation、 Atherosclerosis Signaling、 IL-12 Signaling andProduction in Macrophages四个通路，为儿童恶性血液病发病机制提供了研究线索。　　3.采用ELISA对3个候选蛋白LRG1、S100A8和SPARC在血清中的表达进行了验证，结果与质谱鉴定结果一致。其中S100A8和LRG1在儿童恶性血液病中表达上调，SPARC在儿童AL中表达下调，提示S100A8、LRG1可能与儿童恶性血液病发病有关，SPARC可能与AL发病有关，可作为潜在的分子标志物和治疗靶点，并需要在临床中进行广泛的验证。　　4.SPARC可作为鉴别儿童AL与NHL的蛋白标志物。　　第二部分应用SERPA技术筛选儿童急性B淋巴细胞白血病相关抗原及自身抗体　　背景与目的:急性淋巴细胞白血病（ALL）是儿童时期最常见的血液系统恶性肿瘤，约占15岁以下儿童恶性肿瘤发病率的25％，其中最常见的类型为急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)。目前其诊断主要依靠骨髓穿刺，但因损伤较大患儿依从性差;近年来由于联合化疗和支持治疗的不断完善，儿童ALL的预后有了很大改善，但ALL的发病机制至今不清;化疗难以根除微小残留病变获得长期缓解，仍有约20％的ALL患儿复发，复发后再次化疗常常无效，并且传统的化疗药物对白血病细胞的杀伤作用是非特异性的，其在杀伤白血病细胞的同时也杀伤正常的造血细胞，产生严重的中性粒细胞缺乏和血小板减少等造成化疗相关性死亡。因此，应用靶向治疗方法特异性地杀灭白血病细胞是目前急需解决的问题。越来越多的证据表明在白血病患者体内存在着特异性免疫反应，虽然白血病发病初期血清中的许多抗原由于表达丰度很低不易检测，但机体免疫系统已经能够监测到这些抗原的存在，并产生大量针对该抗原的特异性自身抗体。血清蛋白质组学分析(SERRA)是将蛋白质组学技术与免疫学技术相结合的一种高通量筛选肿瘤相关抗原及自身抗体的新技术，本研究应用SERRA技术以人B-ALL细胞株NALM-6、REH及BALL-1的总蛋白作为肿瘤抗原来筛选儿童B-ALL相关抗原及自身抗体，为儿童B-ALL的早期诊断及治疗奠定基础。　　方法:　　1.首先提取人B-ALL细胞株NALM-6、REH及BALL-1的总蛋白等量混合作为B-ALL抗原来源，再应用双向电泳(2-DE)根据蛋白质等电点、分子量的不同对总蛋白进行分离，获得3张相同的凝胶，其中一块2-DE凝胶经考马斯亮蓝染色作为平行胶，其余两块凝胶经电转印将凝胶中的蛋白质转膜，然后分别与B-ALL患儿血清及正常儿童对照血清进行免疫印迹（Western Blot），获得免疫印迹反应图谱。经计算机图像分析，通过匹配免疫印迹图谱与2-DE凝胶图谱进而识别差异反应的蛋白点（与B-ALL血清反应阳性而与正常儿童血清反应阴性的点），然后在平行的2-DE凝胶上找到与Western Blot中差异反应蛋白质点相匹配的蛋白质点，再对这些差异蛋白进行胰酶酶切及MALDI-TOF/TOF-MS/MS质谱鉴定，从而确定在血清中存在自身抗体的相关抗原，实验重复3次。　　2.为进一步验证筛选得到的B-ALL相关抗原的自身抗体特异性，采用间接ELISA方法检测其中两个蛋白质α-烯醇化酶(ENO1)与电压依赖性阴离子通道蛋白1(VDAC1)的自身抗体在30例B-ALL患儿、30例其他肿瘤患儿及25例正常儿童血清中的阳性率。　　3.采用免疫组织化学方法比较ENO1与VDAC1在儿童B-ALL骨髓与正常儿童骨髓中的表达差异。　　4.应用Western Blot检测ENO1与VDAC1在三株B-ALL细胞株NALM-6、REH及BALL-1的表达差异。　　结果:　　1.应用SERRA技术，在B-ALL细胞株平行胶上筛选出6个差异反应蛋白点（与B-ALL儿童血清反应阳性而与正常儿童血清反应阴性的点），通过质谱鉴定和查询数据库，6个蛋白点分别鉴定为线粒体顺乌头酸酶(aconitase)、凋亡诱导因子(AIF)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLD)、ENO1、中链脂酰基辅酶A脱氢酶(MCAD)、VDAC1。　　2.ELISA结果显示ENO1与VDAC1的自身抗体在B-ALL儿童血清中的阳性率分别为27％和23％，明显高于正常儿童（4％和0），但不高于其他肿瘤患者(23％和17％)。　　3.免疫组织化学结果显示ENO1与VDAC1在儿童B-ALL骨髓均明显高于正常儿童骨髓中的表达。　　4.Western Blot检测结果发现ENO1与VDAC1蛋白表达水平在三株B-ALL细胞株间没有明显差异。　　结论:　　1.Enolase1与VDAC1可能为儿童B-ALL相关抗原。　　2.VDAC1自身抗体有可能发展为潜在的儿童B-ALL的血清学标志分子。