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灵芝是一种珍贵的药食两用真菌,也是一种传统的中药材。灵芝富含多糖、蛋白质、脂肪酸、生物碱、甾醇、萜类、苷类、维生素和矿物质等,具有调节免疫、抗肿瘤、抗衰老、降血脂和降血糖的功效。多糖是灵芝中主要的生物活性成分之一,表现出了显著的免疫调节作用。但过去主要对子实体多糖和灵芝酸类小分子化合物关注较多,对具有培养周期短、产量高和易于纯化等优势的液态发酵生产的灵芝胞外多糖关注较少。多糖的糖链结构与免疫调节等药理活性有着密切的联系,但由于灵芝的产地和种类,以及多糖的提取部位和提取方法的不同,多糖的糖链类型、长度、分支度和支链种类等均存在差异,加之多糖结构复杂,导致其分子结构以及构效之间的关系尚未探明,有待进一步研究。四川灵芝(Ganoderma sichuanense)广泛生长于中国西南地区,被认为是一种具有潜在的免疫调节作用的真菌,但缺乏对其主要活性成分多糖的研究。本文以四川灵芝菌为原料,通过液态培养提取了胞外多糖,对胞外多糖进行了分离纯化和结构表征,并对GSP-1和GSP-3组分进行了甲基化分析和核磁共振分析,进一步解析其复杂结构信息;通过RAW264.7细胞模型在体外评价了免疫调节活性;测定了对活性氧自由基的体外清除能力;初探了结构较明确的GSP-1和GSP-3部分可能的信号转导途径,进一步佐证了其免疫调节作用,探索构效关系。通过本文研究为川灵芝胞外多糖成分的构效关系和作用机制研究以及更深层次的探索提供支撑,为进一步的开发利用川灵芝胞外多糖提供科学依据和理论参考。本文研究主要结论如下:(1)胞外多糖制备。灵芝菌经分子鉴定为四川灵芝(Ganoderma sichuanense)。通过乙醇沉淀提取获得川灵芝菌胞外粗多糖GSP,产率为(2.61±0.33)%。TCA法脱蛋白后获得精制GSP,蛋白含量仅为(3.10±0.41)%。精制GSP经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱和琼脂糖凝胶6B柱进一步的分离纯化,洗脱得到5个多糖组分命名为GSP-1、GSP-2、GSP-3、GSP-4和GSP-5,测定多糖含量分别为(98.71±0.72)%、(97.40±0.78)%、(98.25±0.32)%、(94.10±0.98)%和(93.51±0.75)%,蛋白质含量分别为(0.56±0.36)%、(1.44±0.50)%、(0.86±0.36)%、(1.64±0.63)%和(2.03±0.77)%,糖醛酸含量分别为(0.87±0.40)%、(1.27±0.79)%、(1.67±0.40)%、(4.04±1.19)%和(15.54±3.96)%。HPSEC-RI测定平均相对分子质量分别为5.55×10~6Da、4.9×10~5Da、3.74×10~5Da、2.74×10~5Da、1.51×10~5Da。(2)川灵芝菌胞外多糖的结构表征。刚果红实验表明仅GSP-1具有三股螺旋构象;各组分的表面形貌存在较明显的差异;GSP-1和GSP-2均由甘露糖-葡萄糖-半乳糖-岩藻糖组成,摩尔比分别为0.73:2.21:0.77:0.13和0.96:1.63:0.71:0.13,GSP-3的单糖组成为甘露糖-葡萄糖-半乳糖,摩尔比为0.60:1.27:0.08,GSP-4的单糖组成为甘露糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖醛酸,摩尔比为1.54:3.10:0.25:0.18,GSP-5的单糖组成为甘露糖-葡萄糖-半乳糖-葡萄糖醛酸-半乳糖醛酸,摩尔比为0.20:1.69:0.03:0.19:0.04;综合FT-IR、甲基化和核磁共振分析结果,GSP-1的主链结构主要由→1)-β-D-Glcp-(3→和→1)-α-D-Glcp-(6→组成,在主链和支链上可能还含有→1)-α-D-Manp-(6→,主要的支链出现在β-D-Glcp的O-6位点上,另外主链或支链上均可能出现少量的1,2,3-α-D-Fucp、1,2,6-α-D-Manp和1,2,6-α-D-Glcp,而末端主要为β-D-Galp和部分α-D-Manp。GSP-3的主链骨架主要由→1)-β-D-Glcp-(6→组成,在主链和支链上可能还含有→1)-α-D-Manp-(3→,和少量的→1)-α-D-Glcp-(3→,支链位点可能出现在α-D-Glcp的O-2或O-3处,另外主链或支链上也可能会出现含有1,2,6-α-D-Manp,而末端残基主要为β-D-Manp和少量的α-D-Galp。(3)川灵芝菌胞外多糖的免疫活性分析。通过RAW264.7小鼠巨噬细胞模型在体外评价免疫活性的结果表明,GSP-1、GSP-2、GSP-3、GSP-4和GSP-5能够增强RAW264.7巨噬细胞的增殖、吞噬活性和分泌NO、TNF-α和IL-1β的能力;Western blot实验结果表明,GSP-1和GSP-3能够上调细胞表面的TLR4受体、MAPK p38、NF-κB p65和iNOS的表达。GSP-1和GSP-3可能通过与TLR4受体结合,将信号转导入细胞内,激活MAPK p38和NF-κB p65,而NF-κB被激活后会进一步调控iNOS的表达,共同活化巨噬细胞,提高了吞噬活性和NO、TNF-α、IL-1β等细胞因子的分泌水平,增强了免疫功能。抗氧化活性分析结果表明,GSP-1、GSP-2、GSP-3、GSP-4和GSP-5均具有一定的活性氧自由基清除能力,其中GSP-1的清除作用最强,各组分均存在一定差异。