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肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的5年存活率已升高至50％。然而,肝切除术后5年内复发率高达80％,长期存活率仍然不高。深入研究HCC的转移、复发机制,积极探索有效的抗复发治疗措施等,均是当前HCC诊治中的重点和难点。无论复发肿瘤起源何处,HCC的生长和转移主要依赖于肿瘤局部的微环境,特别是新生血管。基于血管新生在肿瘤进程中的作用,抑制HCC的血管新生已经成为抑制HCC生长和转移的新靶点。而对HCC血管新生尚缺乏充分全面的认识。越来越多的体外实验、动物模型和临床证实:内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)在肿瘤病理状态下能被动员,趋化至肿瘤组织,参与肿瘤血管重建。作为一种高血供肿瘤,HCC细胞能分泌大量细胞因子和趋化因子。这些细/趋化因子许多已被证明能促进EPCs的动员(如血管内皮生长因子)和募集(如基质细胞衍生因子-1)。因此,EPCs很有可能在HCC的血管形成中起重要的作用。另外,低氧是肿瘤血管新生重要的病理生理变化。本课题的研究目的是首先探讨EPCs是否参与HCC血管新生、相关分子机制及其临床意义,尔后体外研究低氧下EPCs的基因表达谱变化。如能明确EPCs参与了HCC的新生血管形成,有望介导EPCs对肿瘤血管实施靶向治疗,为HCC的综合治疗提供新的理论基础。另外,低氧下EPCs的表达谱研究也为肿瘤血管新生提供新的治疗靶点。本研究分为四个部分：
第一节：骨髓动员的内皮祖细胞参与肝细胞性肝癌血管新生的临床研究。
目的：研究骨髓动员的EPCs在HCC组织内的分布规律及其临床意义。
方法：64例HCC肝切除患者和8名健康成人参与本项研究,并收集其外周血、肝组织样本和临床资料。HCC肝组织分为三个部分:肝肿瘤组织、癌旁肝组织和远离癌的肝组织。采用集落形成实验、流式细胞、Real-time PCR评估循环EPCs水平,ELISA测定血浆和组织血管内皮生长因子和血小板源型生长因子水平。通过免疫荧光检测EPCs在肝组织内分布,并采用Real-time PCR和免疫组化测定EPCs的表面标记在HCC肝组织内的相对表达水平。
结果：HCC患者外周血干细胞集落数、AC133基因相对表达水平、血浆血管内皮生长因子和血小板源型生长因子水平均高于健康对照组,且AC133基因相对表达水平与血浆血管内皮生长因子和血小板源型生长因子水平呈正相关。免疫组化结果显示:EPCs整合入肝硬化和HCC组织微血管。癌组织、癌旁肝组织和远离癌的肝组织内AC133微血管密度(0.74mm2)分别为53.56、84.76和48.33,均显著高于正常肝组织AC133微血管密度(9.00)。AC133基因在癌旁肝组织内相对高表达,且与肿瘤临床指标相关,如肿瘤包膜缺乏、静脉侵犯、细胞增殖和肿瘤早期复发等。
结论：骨髓动员的EPCs参与HCC血管新生。外周血或肝组织AC133基因或蛋白可能是判定HCC进展的生物标记。
第二节：内皮祖细胞富集于肝细胞肝癌癌旁组织的分子机制探讨。
目的：我们前期研究报道了EPCs在HCC组织中的分布及其临床意义。研究发现:EPCs更多富集于癌旁肝组织。其异常分布的机理值得进一步研究。
方法：64例HCC肝切除患者和8名健康成人参与本项研究,并收集其外周血和肝组织样本。HCC肝组织分为三个部分:肝肿瘤组织、癌旁肝组织和远离癌的肝组织。采用ELISA测定血浆和组织血管内皮生长因子水平。通过免疫组化检测CD105、低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子、血管内皮黏附分子1、纤维连接蛋白在肝组织内分布,采用Real-time PCR测定CD105的表面标记在HCC肝组织内的相对表达水平。并构建CC14诱导的肝硬化小鼠模型,采用流式细胞检测外周血EPCs,免疫组化评估Sea-1阳性细胞的分布及CM-Dil标记EPCs在肝硬化小鼠体内的分布。
结果：Western blots和免疫组化提示癌旁肝硬化组织内低氧诱导因子1α、CD105和血管内皮生长因子高表达;且CD105和血管内皮生长因子表达呈正相关;免疫组化提示血管内皮黏附分子1和纤维连接蛋白也在癌旁高表达。另外,在CC14诱导的小鼠肝硬化进程中,循环EPCs逐步升高尔后下降,肝硬化组织内Sca-1阳性细胞富集。CM-Dil标记:EPCs定向募集到肝硬化组织。
结论：肝硬化引发癌旁相对的乏氧、黏附分子高表达和内皮细胞激活,促使EPCs动员、定向归巢于癌旁肝组织。
第三节：血管壁来源内皮祖细胞的认定研究。
目的：前期研究证实:正常血管壁含有EPCs。认证人血管壁(选择脐静脉为研究对象)是否含有EPCs及其分布。
方法：采用免疫组化、Real-time PCR和western blots检测人脐静脉和人脐静脉内皮细胞内EPCs的表面标记。
结果：免疫组化结果显示:人脐静脉内膜含有AC133+(2.14±0.57/mm)和KDR+(35.74±8.28/mm)细胞;胰酶消化后,内膜上AC133+KDR+,CD34+和CD105+细胞显著性减少,而中层AC133+和KDR+细胞未显著性减少。消化前后脐带内AC133和KDR mRNA相对水平无显著性变化。源于脐静脉壁的第一代细胞“脐静脉内皮细胞”内AC133+和CD34+双阳性细胞为3.43±3.85％,显著高于第三代(0.17±0.21％,P=0.005)和第六代(0.14±0.18％,P=0.001)。且随着传代AC133和CD105蛋白及mRNA渐进性下降,而KDR蛋白和mRNA渐进性升高。
结论：脐静脉内膜和中层含有部分EPCs。故正常动脉壁源性EPCs可能也是血管新生的细胞来源之一。
第四节：低氧下内皮祖细胞基因表达谱研究。
目的：采用cDNA芯片技术动态检测低氧下EPCs基因表达变化,筛选出低氧相关的关键基因和信号通路。
方法：采用人全基因组表达芯片动态检测低氧下EPCs基因表达变化,尔后进行生物信息学分析。关键基因和蛋白采用Real-time PCR和western blots验证,并采用MTT和流式细胞检测细胞增殖、凋亡和周期。
结果：本实验采用6张人全基因组芯片检测低氧不同时间点(0、3、6、12、24、48小时)EPCs表达谱,1103个基因在3个点以上差异表达1.5倍以上,与代谢相关的基因最多,与信号转导和转运相关的基因次之。将差异基因映射信号通路数据库。其中得到对应有显著意义的信号通路:Apoptosis,Cell Cycle,MAPK Cascade等。低氧诱发EPCs凋亡,主要通过线粒体通路(p53-BAX-Caspase-9)和死亡受体通路(FAS-Caspase-8-Caspase-3)两条途径。低氧下EPCs周期阻滞在S期。MAPK通路不仅参与细胞凋亡和周期阻滞(TGFB2/TGFBR-DDIT3-P53),另外一条通路也调节细胞增殖。并采用Knowledge-driven Network分析筛选出重要的调控因子,如p53、STAT1、NF-kB1、MAPK1和CTNNB1。采用Pwmatch程序预测了低氧下的主要转录因子,如Egr-3,XBP-1,Olf-1,POU3F2,FOX04,ATF6和AP-4等。
结论：低氧诱导EPCs凋亡,周期阻滞,p53基因和MAPK通路起到了关键性作用。