日本沼虾(Macrobrachium nipponense)是我国淡水虾类养殖业中重要的养殖品种之一,分布广泛。环境胁迫是制约水产养殖业健康发展的重要因素之一,其中氨氮和亚硝酸盐是众多化学污染胁迫因子中最为普遍,也是对机体生理功能影响最为显著的水体胁迫因子。本研究首先对日本沼虾在亚硝酸盐胁迫(10.0 mg/L)和氨氮胁迫(22.1 mg/L)下的免疫指标进行了研究,发现肝胰腺作为主要免疫器官,在日本沼虾抗氨氮和亚硝酸盐胁迫中具有重要作用,且48小时是关键时间点,之后分别进行了转录组实验。在亚硝酸盐胁迫实验中,以亚硝酸盐胁迫和未胁迫48h的日本沼虾的肝胰腺为研究对象,构建3个胁迫和3个未胁迫状态下的肝胰腺转录组文库;在氨氮胁迫实验中,以氨氮胁迫和未胁迫48h的日本沼虾的肝胰腺为研究对象,构建2个胁迫和2个未胁迫状态下的肝胰腺转录组文库。文库分别利用高通量测序平台分析鉴定日本沼虾肝胰腺中与氨氮和亚硝酸盐胁迫相关的差异表达基因,对胁迫下与免疫相关通路进行分析,并对与免疫应答相关的差异表达基因进行分析验证。主要研究结果如下:(1)在浓度为10.0 mg/L亚硝酸盐胁迫下,肝胰腺、血液、肌肉、鳃的SOD、T-AOC活性和血液组织的PO活性都有不同程度的变化趋势。肝胰腺、血液、和鳃组织的SOD活性均呈下降趋势;肝胰腺和肌肉的T-AOC活性、PO活性的最高点均出现在48h时间点上。可见肝胰腺作为免疫器官,在机体抗亚硝酸盐胁迫中有重要作用,48h是日本沼虾抗亚硝酸盐胁迫下的关键时间点。(2)在浓度为22.1 mg/L氨氮胁迫下,肝胰腺、血液、肌肉、鳃的SOD、T-AOC活性和血液组织的PO活性和都有明显的变化。肝胰腺、血液、肌肉组织的SOD活性、肝胰腺和肌肉的T-AOC活性、PO活性的最高点均出现在48h时间点上;肝胰腺的SOD和T-AOC活性是四种组织中最高的。可见,肝胰腺在机体抗氨氮胁迫中有重要作用,48h是日本沼虾抗氨氮胁迫下的关键时间点。(3)亚硝酸盐胁迫转录组测序,通过测序平台对构建的6个转录组文库进行测序,GO注释分析后发现,unigenes主要富集在代谢过程、催化活性过程、结合过程和细胞组分。KEGG通路富集到5529个unigenes,其中富集最多的是核糖体通路,RNA转运通路和溶酶体通路。是一共有13960个unigenes注释到26个KOG组中,信号转导机制和一般功能预测是富集最多的组。(4)亚硝酸盐胁迫转录组测序共鉴定出825个差异表达基因,包括762个显著上调基因和63个显著下调基因。对差异基因的GO和KEGG富集分析显示,被显著富集的60条通路中,富集最多的是RNA转运通路、溶酶体通路和嘌呤代谢通路。在免疫相关通路中,主要富集的通路有溶酶体通路、甘油脂代谢通路、吞噬体通路和JAK-STAT信号通路等。(5)在亚硝酸盐胁迫的转录组数据中,经过筛选得到21个与免疫应答相关的差异表达基因,其中19个显著上调,2个显著下调。对21个差异基因进行聚类分析,发现明显聚成两类。21个差异表达基因富集最多的在溶酶体通路,其次是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路、精氨酸脯氨酸代谢通路和JAK-STAT信号通路。(6)对亚硝酸盐胁迫下筛选出的免疫应答相关通路和基因进行研究,通过对溶酶体通路和JAK-STAT信号通路上的差异表达基因进行研究发现,亚硝酸盐胁迫启动了免疫应答相关基因的表达;证明溶酶体通路、JAK-STAT信号通路和相关免疫应答基因在日本沼虾受亚硝酸盐胁迫时,对机体有一定的保护作用。(7)通过氨氮胁迫转录组测序,构建了4个转录组文库进行双末端测序,对每个转录组文库获得的raw reads进行转录拼接,对clean reads进行分析筛选,有2858个unigenes被五大数据库共同注释,对unigenes进行GO注释分析后发现,它们主要富集在代谢过程、细胞过程、单个有机体过程组分。(8)通过筛选,从对照组和胁迫组中一共得到56663个表达的基因(fpkm>0.3)。在两组中共同表达的基因有27466个。对差异表达基因的GO分析显示有344个差异表达基因富集在单一生物体过程,上调基因主要富集在细胞过程(193),下调基因主要富集在代谢过程(188)。对差异表达基因的KEGG分析显示被显著富集的20条通路:补体和凝血级联通路、血小板激活通路和糖酵解/糖异生是被富集的子通路最多的三条通路。(9)在氨氮胁迫的转录组数据中,经过筛选得到44个与免疫应答相关的差异表达基因,包括23个上调基因,21个下调基因。对相关的差异表达基因进行聚类分析,发现明显的聚成两类。KEGG分析显示,主要富集到与免疫系统相关的补体和凝血级联通路、血小板激活通路、抗原处理和呈递通路等。(10)对氨氮胁迫筛选出的免疫相关通路和基因进行研究,发现补体和凝血级联通路是富集免疫相关差异基因最多的通路。对通路上的差异表达基因C3和CFI进行研究,发现氨氮胁迫启动了免疫应答相关基因的表达,证明在日本沼虾受氨氮胁迫时,机体启动了补体和凝血级联通路等对机体有保护作用的免疫应答通路。综上所述,通过对日本沼虾在氨氮胁迫(22.1 mg/L)和亚硝酸盐胁迫(10.0 mg/L)时的免疫指标的影响进行了研究。利用高通量测序平台分别分析鉴定日本沼虾肝胰腺中与氨氮和亚硝酸盐胁迫相关的差异表达基因,对胁迫下与免疫应答相关基因和信号通路进行分析,共检测到825个与亚硝酸盐胁迫相关的差异表达基因和887个与氨氮胁迫相关的差异表达基因,筛选出21个在亚硝酸盐胁迫下免疫应答相关的差异表达基因和44个在氨氮胁迫下免疫应答相关的差异表达基因。筛选出2个与亚硝酸盐胁迫下免疫相关的通路和富集在通路上的免疫关键基因,1个与氨氮胁迫相关的免疫调控通路和富集在通路上的免疫关键基因。这些分子水平的反应证实了所筛选出的与胁迫相关的差异表达基因和细胞信号通路,在日本沼虾抗氨氮和亚硝酸盐胁迫的保护机制中起着重要的作用。这些基因和通路可作为应激条件下日本沼虾自身防御反应的分子免疫学指标。本研究产生了大量的数据,这为今后进一步揭示虾的免疫防御机制奠定了基础,也为日本沼虾的免疫反应提供了新的思路;为培育抗氨氮和亚硝酸盐胁迫的新品种奠定了基础。