目的:长期的高氧治疗会对机体器官有严重的毒性作用。活性氧(reactiveoxygen species，ROS)包括超氧自由基和过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)，过多生成的ROS对机体来说是有害的。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)是炎症反应的中心介质，作为一种促炎细胞因子能够在高氧状态下介导炎症反应，同时炎症反应时，ROS能够诱导细胞因子的产生，并且增加的细胞因子会影响免疫球蛋白A(ImmunoglobulinA，IgA)和分泌片（secretory component，SC）的表达，过量产生的ROS通过转录因子蛋白家族(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号通路扩大炎症反应。凋亡信号调节激酶1（Apoptosis signal-regulating kinase1，ASK1）作为MAPK家族的一个成员能够被ROS、TNF-a激活，并且在由氧化应激诱导的细胞凋亡过程中发挥重要作用。低氧诱导因子(Hypoxia inducible factor-1-α，HIF-1-α)在修复缺氧诱导基因和细胞氧环境中起着关键作用，与炎症性肠病的发病机制高度相关。　　因此通过检测肠上皮细胞内ROS水平的变化进一步探讨ROS在高氧诱导的肠上皮细胞炎症反应中的作用，通过检测NF-κB信号通路、ASK1和HIF-1-α的变化探讨ROS参与高氧诱导肠上皮细胞炎症反应机制。　　研究方法:本研究利用不同浓度的过氧化氢和高氧体外刺激肠上皮Caco-2细胞（Caco-2细胞株购于中国科学院上海细胞生物学研究所），细胞培养在含10％胎牛血清，1％谷氨酰胺，1％双抗的DMEM高糖培养基中，放入37℃和5％ CO2孵箱中培养。每2到3天换一次培养基，处理前，将细胞(1×106 ml)传代，第二天，细胞在不同浓度的H2O2(100，200和400μM)和85％氧（三气培养箱，85％的氧气和5％的二氧化碳）中孵育24小时，未加任何处理因素的作为对照组。24小时后收集细胞，分别提取全蛋白质、RNA和进行其他不同的实验，即采用流式细胞术检测细胞内ROS的含量;MTT检测细胞生存能力;流式细胞术检测细胞凋亡水平;免疫组化方法检测Caco-2细胞RelA、RelB、HIF-1-α、TNF-α和SC的表达情况;Western Blot方法检测Caco-2细胞RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC蛋白的表达水平;Real-time PCR方法检测Caco-2细胞RelA、RelB、ASK、HIF-1-α、TNF-α和SC mRNA的表达水平。所有的实验重复6到8次。实验数据采用Mean±SD表示，采用Prism Graph6.0软件统计分析，多组间比较采用非配对t检验(unpaired t-test)，结果以P＜0.05有统计学意义。　　结果:1、ROS检测结果显示对照组(21.45±9.34)有少量的ROS表达，实验组100μM H2O2、200μM H2O2、400μM H2O2中随着H2O2浓度的增加ROS的表达逐渐增加，而高氧组（139.19±34.79）ROS的表达最高，差异有统计学意义(P＜0.05);2、MTT细胞增殖实验结果显示与对照组(1.25±0.25)相比，100μM H2O2、200μMH2O2、400μM H2O2组中细胞的存活率均明显下降(P＜0.01)，高氧组(0.52±0.06)细胞存活率下降更明显(P＜0.01);3、细胞凋亡检测结果显示细胞被H2O2和高氧处理6小时后，实验组100μM H2O2(9.70±3.14)、200μM H2O2(10.73±2.29)、400μM H2O2(11.52±2.80)和85％高氧组(17.90±5.91)细胞凋亡率明显高于对照组(4.60±1.98);细胞被H2O2和高氧处理12小时后，实验组100μMH2O2、200μMH2O2、400μMH2O2和85％高氧组(15.95±3.56)细胞凋亡率明显高于对照组(5.33±2.62)，细胞凋亡率随着ROS浓度的增加而升高，并且高氧组细胞凋亡率最高(P＜0.01);但细胞被H2O2和高氧处理24小时后，实验组100μM H2O2、200μMH2O2、400μM H2O2和85％高氧中细胞凋亡率反而降低(P＜0.01)。不同浓度的H2O2及高氧处理6小时和12小时后，其细胞凋亡率明显高于24小时(P＜0.01)。但死亡率却相反，即H2O2和高氧处理6小时细胞死亡率分别为:100μMH2O2（1.20±0.37）、200μM H2O2（9.52±2.03）、400μM H2O2（15.26±2.39）及高氧（19.64±1.80）;处理12小时细胞死亡率分别为:100μMH2O2（8.67±0.14）、200μM H2O2（12.95±1.99）、400μM H2O2（17.76±1.50）及高氧（23.31±1.66）;处理24小时细胞死亡率分别为100μM H2O2(6.23±3.83)、200μM H2O2(14.74±1.24)、400μM H2O2(19.90±4.57)及高氧（37.35±6.55），6小时细胞死亡率明显低于12小时和24小时(P＜0.01);4、RelA、RelB、HIF-1-α、TNF-α和SC的免疫组化染色结果显示对照组RelA和RelB位于细胞浆，呈淡黄色，在H2O2组和高氧组RelA和RelB位于细胞浆与细胞核，呈棕褐色。RelA与对照组相比，实验组100μM H2O2、200μM H2O2、400μM H2O2和高氧组的表达明显升高(P＜0.01);与高氧组相比，100μM H2O2、200μM H2O2和400μM H2O2处理的Caco-2细胞，RelA的表达较低(P＜0.01)。RelB与对照组相比，实验组100μM H2O2、200μM H2O2、400μM H2O2和高氧组的表达明显升高(P＜0.01);与高氧组相比，100μM H2O2、200μM H2O2和400μMH2O2处理的Caco-2细胞，RelB的表达较低(P＜0.01)。对照组TNF-α染色呈浅黄色，实验组细胞呈黄或棕褐色。100μM H2O2、200μM H2O2、400μM H2O2和高氧组处理后的Caco-2细胞TNF-α的表达明显高于对照组(P＜0.01);与高氧组相比，100μM H2O2、200μM H2O2和400μMH2O2处理的Caco-2细胞，TNF-α的表达较低(P＜0.01)。HIF-1-α主要集中于细胞浆，在对照组有少量的表达呈浅黄色，在H2O2组和高氧组HIF-1-α阳性细胞数明显增多，染色呈黄或棕褐色。与对照组相比，HIF-1-α在100μM H2O2、200μMH2O2、400μM H2O2和高氧组中表达升高(P＜0.01);与高氧组相比，100μMH2O2、200μMH2O2和400μM H2O2处理的Caco-2细胞，HIF-1-α的表达较低(P＜0.01)。SC主要位于细胞膜和细胞浆，与对照组相比，SC在200μM H2O2和400μM H2O2和高氧组中表达明显升高(P＜0.01);与高氧组相比，100μM H2O2、200μM H2O2和400μM H2O2处理的Caco-2细胞，SC的表达较低(P＜0.01)。5、Western Blot结果表明在H2O2和高氧处理的Caco-2细胞中，RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC的蛋白表达水平显著上升，高氧组RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、 TNF-α和SC的蛋白表达水平明显高于对照组RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC(P＜0.01)。6、Real-time PCR结果表明在H2O2和高氧处理的Caco-2细胞中，RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC的mRNA表达水平显著上升，高氧组RelA(1.77±0.27)、RelB(2.23±0.53)、ASK1(1.81±0.35)、HIF-1-α(1.90±0.40)、TNF-α(2.14±1.04)和SC(2.10±0.67)的mRNA表达水平明显高于对照组RelA(0.71±0.22)、RelB(0.58±0.15)、ASK1(0.80±0.19)、HIF-1-α(0.64±0.16)、TNF-α(0.65±0.31)和SC(0.70±0.29)(P＜0.01), RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC的mRNA表达水平随着H2O2浓度的增加而升高，与蛋白表达一致。　　结论:1、高氧诱导肠上皮细胞释放大量ROS;2、ROS是高氧致肠上皮细胞发生炎症反应的主要原因，在此过程中NF-κB和ASK1信号通路参与调节。