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本室近年对双胸蚓的研究发现,其组织内含有非常强的能够杀灭微生物、尤其是病毒的活性成分,并经初步的研究表明,这些组分具有降解多种DNA和RNA的活性,推测应是双胸蚓组织中含有的核酸酶。为了进一步确定双胸蚓组织中核酸酶的种类、数量、酶学性质、结构、生物学功能及作用机制,本研究从建立一系列灵敏、适用于各种特性的核酸酶样品的活性测定方法入手,系统地研究了双胸蚓组织核酸酶粗提液在各种理化条件下的稳定性,并以此为依据,探索、研究了分离、纯化双胸蚓组织核酸酶的技术路线,对双胸蚓组织中多种核酸酶进行了分离纯化。一、双胸蚓组织核酸酶活性测定方法体系的建立鉴于本研究中的核酸酶的作用特征是能够降解核酸(DNA和(或)RNA),采用单相酶扩散法、琼脂糖凝胶电泳法、紫外分光光度法等技术,以DNA和RNA作为反应底物,建立酶促反应体系,通过分析底物的降解程度、降解方式,或者产物的增加(增色效应),鉴定样品中是否含有核酸酶及其活力大小,并推测可能的酶学机制。经过长时间摸索和试验,建立并确定以下测活方法:1.单相酶扩散法(SRED,平板法);2.琼脂糖凝胶电泳法;3.紫外分光光度法;4. PAGE-咪唑-氯化锌反染技术;5. PAGE-DNA功能胶测活法;6. PAGE-考马斯亮蓝R-250染色比对切胶测活法;7.干琼脂糖薄膜覆盖法(DAFO)。二、双胸蚓组织核酸酶粗提液制备工艺和理化性质的研究本部分研究采用琼脂糖凝胶电泳、单相酶扩散等方法对制备双胸蚓组织粗提液过程中影响核酸酶活性的各种因素、粗提液的酸、碱稳定性、温度稳定性, PAGE、SDS-PAGE电泳过程中的理化因素对核酸酶活性的影响等进行了研究。确定机械法为快速、有效的制备双胸蚓组织匀浆的方法,以0.1mol/L NaAc/HAc (pH4.6)缓冲液作为抽提双胸蚓组织匀浆中核酸酶的基本提取液。双胸蚓组织核酸酶粗提液稳定性的研究结果表明:其最适pH范围在4.0-5.4之间;粗提液中的核酸酶对温度稳定;无水乙醇、丙酮不破坏其中的核酸酶活性,并且在无水乙醇、丙酮含量达50%时,所有活性组分均进入沉淀中;55%硫酸铵沉淀的蛋白质,含有较低的核酸酶活性,表明盐析后活性组分主要保留在上清中。PAGE电