【背景】乙肝病毒(Hepatitis B virus, HBV)相关性疾病仍然是当今威胁人类健康的主要疾病之一。全球大约有乙肝病毒携带者3.5-4亿人。我国是乙肝的高发区,乙肝病毒携带者有1.2亿之多,约占我国人口的9%。5年期间,约10-20%慢性肝炎患者可发展成肝硬化。6%-15%肝硬化和慢性肝炎患者可发展成肝癌。发生肝癌后的5年存活率不到5%。而目前的重组干扰素及核苷类似物等抗病毒治疗手段由于持久效应低下、副作用、耐药等导致疗效不够满意,乙肝病毒复杂的复制调控过程阻碍着研究人员去寻找有效的治疗途径。因此,在探讨乙肝病毒复制的分子机制基础上寻找有效的治疗靶点是目前研究的热点。现有研究显示:虽然影响HBV复制的因素很多,如病毒自身编码蛋白、细胞周期、免疫调节因子等,但是HBV基因组的转录是病毒复制过程中最关键的步骤,目前对HBV基因组的转录调控尚缺乏整体认识。已有研究表明:一些肝细胞富集转录因子如HNF1、HNF3、HNF4和C/EBP等在HBV的转录调控过程中发挥重要作用,但这些发现并未完全揭示HBV转录调控的机制。这就提示,可能存在未知的调控HBV复制的转录因子,以及这些已知和未知的转录因子之间可能存在着相互作用的网络关系,共同调控着HBV转录与复制。因此,寻找新的调控HBV复制的转录因子并阐明它们的作用机制,对揭示HBV在体内复制的分子机制和寻找新的抗病毒治疗靶点具有重要意义。【目的】筛选调控乙肝病毒复制的新的转录因子,并探讨这些转录因子在乙肝病毒复制中的作用及其机制,为进一步阐明HBV在体内复制的分子机制提供有益的补充,并为寻找新的抗病毒治疗靶点提供理论依据。【方法】1.采用转录因子活性谱芯片检测乙肝病毒稳定复制的肝癌细胞系HepG2.2.15及其亲本细胞HepG2转录因子活性谱的变化,对照注释文件,找出活性差异的转录因子。2.利用酶联免疫吸附实验(ELISA方法)对芯片结果进行验证;3.利用免疫细胞化学检测转录因子FoxO3a亚细胞定位;4.用Western blot检测细胞中的FoxO3a磷酸化水平;5.收集患者乙肝病毒髙复制和低复制肝组织,Western blot检测组织中FoxO3a磷酸化水平,分析FoxO3a的活性和HBV复制之间的关系;6.构建FoxO3a-siRNA表达载体,通过细胞转染,下调HepG2.2.15细胞中FoxO3a的表达;7.通过实时荧光定量PCR检测FoxO3a-siRNA对HepG2.2.15细胞中HBV DNA和mRNA水平的影响,ELISA检测FoxO3a-siRNA对HbsAg和HbeAg蛋白水平的影响;8.克隆HBV启动子/增强子不同截短体,构建含HBV启动子/增强子序列的荧光素酶报告基因载体;报告基因实验检测FoxO3a对HBV的转录活性的影响;9.染色质免疫共沉淀(ChIP)方法验证细胞内FoxO3a与HBV启动子或增强子的结合;10. EMSA实验确定HBV启动子/增强子中FoxO3a结合位点;11.通过MTT试验检测FoxO3a-siRNA对肝癌细胞体外增殖能力的影响;12.通过流式细胞术分析FoxO3a-siRNA对肝癌细胞细胞周期的影响,Western blot检测FoxO3a-siRNA转染的肝癌细胞系细胞周期相关蛋白的表达。【结果】1.在芯片注释文件Matrix矩阵中查找转录因子活性谱芯片中表达差异点所对应的转录因子,共筛选出12个转录因子家族分子在乙肝病毒稳定复制的肝癌细胞系HepG2.2.15和其亲本细胞HepG2中活性差异明显(>1.5倍),其中,在HepG2.2.15细胞中活性上调的转录因子有:HNF(1,3,4),C/EBP,FoxO (1,3a,4),FOXI1,SF-1,GR,SRY,COUP-TF1;活性下调的转录因子有AP1,AP2,SP(1,2,3,4),Egr(1,2,3);其中有5个家族分子尚未报道与HBV复制相关,它们分别是FoxO (1,3a,4),Eg(r1,2,3),FOXI1,SRY,AP2;在这5个家族分子中,以FoxO(1,3a,4)家族和AP2家族活性差异最为明显;2. ELISA结果显示:与对照细胞HepG2相比,FoxO(1,3a,4)在HepG2.2.15细胞中活性明显上调;而AP2在HepG2.2.15细胞中活性明显下调,与芯片结果一致;3.免疫荧光细胞化学结果显示,在HepG2细胞,FoxO3a主要定位细胞浆,而在HepG2.2.15细胞,FoxO3a主要定位细胞核; 4.Western blot结果显示,FoxO3a的磷酸化蛋白水平在HepG2细胞明显呈高表达,而在HepG2.2.15呈低表达,p<0.05,具有统计学意义;5. Western blot检测组织标本中FoxO3a的磷酸化蛋白水平,结果表明:在7例HBV高复制的肝组织中FoxO3a磷酸化水平显著低于6例低复制肝组织;6.将FoxO3a-siRNA表达载体瞬时转染HepG2.2.15细胞,Western blot结果证实,FoxO3a-siRNA能显著降低FoxO3a的表达;7.实时荧光定量PCR实验结果显示,FoxO3a-siRNA能显著抑制HepG2.2.15细胞上清和细胞内的HBV DNA的水平;8.实时荧光定量PCR实验结果显示FoxO3a-siRNA能显著抑制HepG2.2.15细胞的HBV mRNA的水平;9.ELISA的结果表明:FoxO3a-siRNA能显著抑制乙肝病毒HBsAg和HBeAg蛋白水平,并且具有时间依赖性; 10.通过生物信息学分析,我们发现,在HBV的启动子/增强子区域有4个潜在的FREs(FoxO3a的DNA结合序列:(G/C)(T/A) AA(C/T)AA),将其成功亚克隆入报告基因载体,双荧光素报告基因结果表明:1)FoxO3a可以直接调控HBV的转录活性;2)FoxO3a调控HBV的转录活性的潜在FRE位于FRE1(HBV基因组955-1184的区域内); 11.CHIP实验进一步证实在HepG2.2.15细胞内FoxO3a同样可与HBV增强子的结合,结合区域同报告基因结果(HBV基因组955-1184的区域内);12.EMSA结果证实FoxO3a通过与HBV增强子Ⅰ序列1127-1134bp(5’-GTAAACAA-3’)位点结合,增加HBV增强子Ⅰ的活性; 13.流式细胞术检测周期发现,FoxO3a-siRNA导致HepG2.2.15细胞周期进展,Western blot结果表明,FoxO3a上调P27KIP1的表达,而下调cyclinD1和cyclinD2的表达。14.生长曲线实验表明,FoxO3a-siRNA能促进肝癌细胞体外增殖能力。【结论】1.宿主细胞转录因子在乙肝病毒稳定复制的肝癌细胞系和其亲本细胞中存在活性差异,众多已知和未知的转录因子可能参与乙肝病毒的复制;2. FoxO3a在乙肝病毒感染的细胞和组织中活性增高;3. FoxO3a能促进乙肝病毒的体外复制;4. FoxO3a促进乙肝病毒复制的分子机制包括两个方面:一是FoxO3a通过与HBV增强子Ⅰ区域1127 - 1134bp(5’-GTAAACAA-3’)位点的结合,增加HBV增强子Ⅰ的活性,促进HBV的转录;二是通过上调P27KIP1,下调cyclinD1和cyclinD2的表达导致细胞周期G1/S期阻滞,从而促进乙肝病毒的复制。