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目的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB,结核菌)临床分离株生长缓慢、培养难,还易被其它分枝杆菌交叉污染,缺乏高特异性、超灵敏的生物诊断标志物,为结核病(Tuberculosis,TB)的临床精准鉴别诊断和及时治疗带来困难。故建立快速、精准、特异、灵敏的结核病检测技术是控制结核病蔓延的必要前提和基础。前期课题组利用深度覆盖和精准蛋白质组技术对MTB H37Rv菌株进行了高覆盖蛋白质组研究,发现并验证了22个MTB遗漏注释基因,其中一半的基因属于MTB特异性基因。本研究旨在进一步筛选出可用于结核菌体液免疫检测的特异性基因编码蛋白抗原及抗原组合,为将来结核病的快速诊断及试剂盒的开发提供技术支撑。方法首先克隆目的基因,并且为选出高可溶性表达的载体,建立大肠杆菌异源表达体系。分别筛选了p GEX-4T-2、p ET-28a、p ET-32a、p MAL-c2X四种表达载体构建目的基因的重组表达菌株;尝试目的基因密码子和表达条件优化,实现异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导目的蛋白的可溶性表达后进行亲和纯化;对纯化获得的目的蛋白进行质谱验证;基于Bepipred Linear Epitope Prediction(BLEP,v2.0)、Bio Sun和Dlbepitope软件对这些新编码蛋白进行B细胞可信表位的预测;并用酶联免疫吸附试验(ELISA)技术评估这些新编码蛋白在结核病体液免疫诊断中的潜在应用价值。结果1四种不同载体中,pMAL-c2X表达载体均有效实现了22个新编码蛋白的可溶性诱导表达。纯化获得的新基因编码蛋白经质谱检测,序列正确。2经Bepipred Linear Epitope Prediction(BLEP,v2.0)、Bio Sun和Dlbepitope软件进行B细胞表位预测,发现这些新蛋白均具有高可信的表位,且为先前尚未报道的表位。3初步血清学比较发现,p MAL-c2X空载在检测中背景干扰最小,适于后续融合表达蛋白的血清学抗原性筛选。对p MAL-c2X载体获得的融合蛋白进行了血清学检测,共筛选到2个潜在抗原TB38.76和TB26.88。抗原TB38.76在结核病患者的灵敏度是68.33%,特异度为72.5%。TB38.76在菌培养阳性的患者中,灵敏度是90%,特异度为55%;抗原TB26.88在菌培养阳性患者中,灵敏度是80%,特异度为50%。4 TB26.88、TB38.76、38 k Da蛋白和商品化试剂盒(上海荣盛结核分枝杆菌Ig G抗体检测试剂盒)进行并联试验或串联试验后,具有互补性,可有效提高对结核病的诊断效率。结论1利用大肠杆菌异源表达系统,基于p GEX-4T-2、p ET-28a、p ET-32a、p MAL-c2X四种载体成功构建了22个MTB新基因的重组质粒,且在p MAL-c2X载体中均实现了高可溶性诱导表达。2 22个新抗原筛选获得了2个潜在的新抗原TB26.88和TB38.76,与已知抗原和商品化试剂盒在结核病诊断中呈现互补性,为将来组合抗原的优化及试剂盒开发提供了科学依据。图12幅;表18个;参116篇。