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背景:我国的胃癌早期诊断率一直偏低,导致胃癌的治疗效果一直不令人满意,针对胃癌癌前病变进行干预代表着对胃癌积极防御的有效策略。慢性萎缩性胃炎作为胃癌癌前病变的一种,在胃癌的发展中处于重要的中间环节,该阶段如能有效治疗和干预,实现逆转,使病变恢复正常,则可能降低胃癌的发生率。目前对于慢性萎缩性胃炎尚无明确的逆转方法,这有赖于对其具体发病机制的进一步深入探究。前期课题组通过全国多中心随机双盲安慰剂对照的IV期临床试验证明羔羊胃提取物维B12胶囊对于慢性萎缩性胃炎尤其是伴肠化生的病例具有明显的逆转效果,为了进一步完善相关证据,并探索可能涉及的机制,我们以大鼠为模型进行了基础实验研究。目的:探索羔羊胃提取物维B12胶囊对于大鼠慢性萎缩性胃炎及肠化生的逆转效果,并探索其可能涉及的机制。方法:1、综合文献报道,通过“MNNG+化学刺激+低酸+不规律饮食”多种因素的刺激,诱导建立大鼠慢性萎缩性胃炎模型。具体方法为:6周龄的Wistar大鼠随机分为2组,其中造模组大鼠32只,正常对照组10只,给予造模组Wistar大鼠100μg/ml的MNNG溶液自由饮用,0.03%的雷尼替丁饲料作为食物,每周空腹灌胃1次50%酒精及饥饱失常1次的刺激,共计20周,以建立大鼠慢性萎缩性胃炎的模型,正常组大鼠给予等量生理盐水灌胃及正常饮食。期间每周1次记录好大鼠进食饮水量及体重变化等数据。造模结束后正常饮食1.5个月,于最后一天饥饿24小时后造模组大鼠处死10只,正常对照组处死5只,收集各组大鼠胃液、血清及胃组织标本,通过检测各组大鼠胃液p H水平及HE染色、免疫组化染色和AB-PAS染色的方法观察大鼠胃粘膜病理改变,判断造模是否成功及病变严重程度,为下一步观察药物疗效实验打好模型基础。2、给予羔羊胃提取物维B12胶囊治疗阶段,将原造模组大鼠(共16只)随机分为两组,分别为给药组和非给药组,每组8只,另外设造模结束后正常组剩余的5只大鼠为阴性对照组,共计三组。给药组按照0.02g/100g的体重比例灌胃给予羔羊胃提取物维B12胶囊药物溶液,正常对照组及非给药组均灌胃等量的生理盐水,各组刺激均持续3个月完成给药治疗实验,于最后一天饥饿24小时之后处死各组大鼠收集胃液、血清及胃组织标本,期间每周记录各组大鼠进食饮水量及体重变化等数据。通过对比各组大鼠胃液p H水平变化及HE染色、免疫组化染色和AB-PAS染色的方法观察各组大鼠胃粘膜病理改变情况,判断羔羊胃提取物维B12胶囊对大鼠慢性萎缩性胃炎的治疗效果。3、通过相应试剂盒检测相关血清氧化应激因子(SOD、GSH-Px、MDA)水平变化及Ki-67和Bax免疫组化染色,判断羔羊胃提取物维B12胶囊逆转大鼠慢性萎缩性胃炎过程中可能涉及的机制通路,为下一步具体的机制探索指明方向。结果:1、大鼠慢性萎缩性胃炎的成功建立:造模期间,造模组大鼠进食量、饮水量及体重增加值均小于正常对照组,其中体重变化自第4周开始出现统计学差异(造模组240.16±21.62g vs.正常组291.00±35.52g,P<0.05)。造模结束时,发现造模组大鼠胃液p H值高于正常对照组大鼠(造模组3.56±0.62 vs.正常组2.01±0.56,P<0.05)。HE染色显示,正常对照组大鼠胃窦粘膜固有层腺体丰富,腺体形态结构正常,未见炎症细胞浸润、腺体萎缩或结构异常等病变;造模组大鼠胃窦大小弯侧粘膜固有层腺体数目则显著减少,腺体结构紊乱,排列失去规则,大小不一,腺体间隙变宽,出现明显炎症细胞浸润。对两组大鼠病变进行定量评分统计分析,发现炎症(造模组2.30±0.64 vs.正常组0.00±0.00,P<0.05)、萎缩(造模组2.20±0.63 vs.正常组0.00±0.00,P<0.05)及肠化生病变(造模组0.70±0.82 vs.正常组0.00±0.00,P<0.05)的评分均有统计学差异。另外,造模组大鼠粘膜层显著变薄,黏膜肌层厚度增加,粘膜层与黏膜肌层厚度比值显著减小(6.34±1.05 vs.2.41±0.77,P<0.05)。AB-PAS染色结果显示造模组大鼠腺体密度明显降低(造模组7.53±2.31 vs.正常组13.43±1.26,P<0.05)。两组大鼠出现慢性萎缩性胃炎的病例统计结果显示,造模组大鼠萎缩率达到100%,肠化率达到50%,对照组大鼠未出现萎缩和肠化,差异有统计学意义。2、羔羊胃提取物维B12胶囊能够成功逆转大鼠慢性萎缩性胃炎:给药后观察发现,给药组大鼠体重增量逐渐大于非给药组,约在给药第六周后两组大鼠体重差异开始出现统计学意义(给药组508.26±33.96 vs.非给药组495.50±23.01,P<0.05)。给药组大鼠胃液p H值略高于正常对照组大鼠,但低于非给药组大鼠,给药组与非给药组相比差异有统计学意义(给药组3.07±0.55 vs.非给药组4.45±0.72,P<0.05)。对给药组和非给药组大鼠病变进行定量评分统计分析,发现炎症评分(给药组1.43±0.53 vs.非给药组2.14±0.69,P=0.051)无统计学差异,而萎缩(给药组1.57±0.79 vs.非给药组2.71±0.49,P=0.007)和肠化生病变(给药组0.71±1.50 vs.非给药组3.57±0.79,P=0.001)的评分均有统计学差异。给药组大鼠胃黏膜层与黏膜肌层厚度与正常对照组大鼠较接近,非给药组大鼠胃粘膜层厚度仍明显减低,黏膜肌层厚度明显增加,二者比值与给药组相比也减小,两组比值差异有统计学意义(给药组3.78±0.45 vs.非给药组2.37±0.38,P<0.05)。非给药组大鼠胃粘膜单位长度(1mm)内腺体数目均值为7.47±2.06,明显小于给药组大鼠的9.58±1.51(P<0.05)。统计胃粘膜表面增生结节数目发现,胃底、胃窦及全胃范围内给药组与非给药组数目均有统计学差异(见正文第二部分图2-3)。各组大鼠胃粘膜病变总体统计结果显示,给药组大鼠重度萎缩率和肠化率明显小于非给药组大鼠(重度萎缩率:给药组14.29%vs.非给药组71.43%,P<0.05;肠化率:给药组28.58%vs.非给药组57.14%,P<0.05)。3、羔羊胃提取物维B12胶囊逆转慢性萎缩性胃炎病变涉及的潜在机制:Ki-67组化染色显示,给药组病变处增殖活力增高,活力与正常组相当,未给药组的相同组织部位增殖活力低于给药组,统计发现给药组与非给药组无统计学差异。Bax组化染色显示,给药组病变处细胞凋亡减轻,未给药组的相同组织部位凋亡染色结果强于给药组,提示羔羊胃药物可能抑制胃组织细胞的凋亡,从而避免萎缩加重。比较各组大鼠血清氧化应激因子水平发现,给药后,给药组大鼠的血清SOD水平和GSH-Px水平明显升高,MDA水平则显著下降,与正常组大鼠血清相应因子水平差距减小,与非给药组相比,差异有统计学意义(具体统计结果见正文第二部分表2-7、表2-8和表2-9)。结论:1、利用Wistar大鼠给予其100μg/ml的MNNG溶液自由饮用,0.03%的雷尼替丁饲料作为食物,每周空腹灌胃1次50%酒精及饥饱失常的刺激方法,历时20周,可以成功建立大鼠慢性萎缩性胃炎的病变模型,并且成功率高,模型稳定性好。2、羔羊胃提取物维B12胶囊可以极大改善大鼠萎缩病变和逆转肠化生,并可能防止癌变。3、羔羊胃提取物维B12胶囊对大鼠慢性萎缩性胃炎的治疗作用涉及的机制可能是促进了正常腺体的增殖和抑制了异常的腺体凋亡及氧化应激反应。