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背景：
急性肝损伤(acute liver injury，ALI)是危害人类健康的常见疾病，主要由病毒感染、肝毒性药物、免疫等因素引起。严重或持续的肝损伤最终可导致肝功能衰竭或进展为慢性肝病、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。目前，ALI的发病机制尚不完全清楚，需要更多的理论支持。而对人类ALI发病机制的研究与治疗药物的筛选，在很大程度上依赖于良好的动物模型的建立和应用。刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)诱导的ALI及肝纤维化的病变过程可能与炎症反应、免疫反应、氧化应激、TLRs通路激活等相关，因而与人类免疫性肝炎及肝纤维化的病理机制较为接近，被学者们广泛应用。
5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是一种经典的神经递质，有中枢及外周源性两种，其中外周型约占95%。色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase，TPH)是合成5-HT的关键酶，有TPH1和TPH2两种形式，分别调节外周和中枢型5-HT。既往研究表明，外周型5-HT在消化系统疾病、炎症反应、免疫反应、代谢等过程中均发挥着重要作用。最新的基础与临床研究也发现，外周型5-HT可参与病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝、肝纤维化及肝癌等多种肝脏疾病的病理过程。其机制可能与5-HT调节炎症反应、氧化应激等有关。然而，有关外周型5-HT在ConA诱导的肝损伤中的作用，目前尚无文献报道。
目的：
既往研究表明，5-HT在肝脏的生理病理过程中发挥着双刃剑的作用。一方面，5-HT有利于肝切除术后的肝再生；另一方面，5-HT还可能加重非酒精性肝病、肝纤维化、肝癌等疾病的进展。本课题旨在探讨：1)5-HT在ConA诱导的ALI中的作用及可能的机制；2)5-HT通过何种受体发挥作用及通过干预该受体改善ConA肝损伤的可行性；3)5-HT在ConA诱导的肝纤维化中的作用。
方法：
1.首先，为了寻找较合适的造模浓度，我们分别给予野生型(wild-type，WT)C57BL/6小鼠单次尾静脉注射不同浓度的ConA(8mg/kg、15mg/kg及25mg/kg三个浓度)，以制造不同程度的ConA肝损伤模型，比较各组小鼠的肝损伤情况及24h死亡率；全自动生化分析仪检测造模后谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)及谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平的变化；然后利用ELISA试剂盒动态监测造模后小鼠血清中5-HT水平及炎症因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ及TNF-α的变化；
2.然后我们进一步探讨5-HT在ConA肝损伤中的作用及可能的机制。我们将小鼠分为5组：WT小鼠对照组(WT+NS)和造模组(WT+ConA)，TPH1敲除小鼠(体内5-HT缺乏)对照组(TPH1-/-+NS)和造模组(TPH1-/-+ConA)，以及TPH1敲除小鼠补充5-羟色胺酸(5-hydroxytryptophane，5-HTP，为5-HT的前体，可恢复体内5-HT)恢复5-HT后造模组(TPH1-/-+5-HTP+ConA)。造模成功后取各组小鼠的血液及肝脏组织。利用ELISA试剂盒验证各组小鼠血清中基础5-HT的水平的差异；利用上述分组的方法，给予各组小鼠以亚致死剂量的ConA尾静脉注射，观察并比较其5d的生存情况；全自动生化分析仪检测比较小鼠血清中转氨酶水平；HE染色比较肝组织的病理损伤程度；ELISA试剂盒检测血清中炎症因子的水平；qRT-PCR检测肝组织内炎症因子mRNA水平；利用试剂盒检测比较肝组织中氧化应激相关指标谷胱甘肽(glutathione，GSH)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、一氧化氮(nitric oxide，NO)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的含量；利用westernblotting的方法检测肝组织内凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白的表达情况；Tunel染色比较肝细胞的凋亡程度；通过westernblotting检测肝组织内HMGB1、TLR2、TLR4、TLR9及下游分子MyD88、IRAK1、TRAF6及NF-κB蛋白的表达水平
3.然后我们分析了5-HT通过何种受体发挥作用。我们首先检测了造模后肝内5-HT2A和5-HT2B受体的变化情况，然后探讨与ConA肝损伤相关的5-HT2A受体的拮抗性药物酮色林能否改善ConA肝损伤。我们将WT小鼠分为3组：对照组(NS)、造模组(ConA)及造模的同时腹腔注射酮色林组(ConA+ketanserin)。首先通过westernboltting验证酮色林能否降低小鼠肝组织内的5-HT2A受体；然后我们采用上一部分的实验方法，分别探讨在ConA肝损伤中，酮色林能否减轻小鼠肝功能损伤、肝组织病理损伤、氧化应激损伤、肝细胞凋亡，能否抑制HMBG1-TLRs通路及减轻炎症反应。
4.最后我们初步探讨了5-HT在ConA慢性刺激致肝纤维化中的作用。该部分中，我们将小鼠分为四组：WT小鼠对照组及造模组(造模方法：ConA12mg/kg,1次/w，连续8w)，TPH1-/-敲除小鼠对照组及造模组。造模成功后取各组小鼠的血液及肝脏组织。利用ELISA试剂盒动态监测造模后小鼠血清中5-HT水平的变化；全自动生化分析仪检测比较小鼠血清中ALT和AST水平；HE染色比较肝组织的病理损伤程度；SiriusRed染色比较肝组织内胶原纤维的含量；进一步通过试剂盒检测肝组织内羟脯氨酸的含量，比较胶原蛋白的水平；最后通过westernblotting比较各组肝组织内α-SMA及TGF-β1的表达水平。
结果：
1.15mg/kg的ConA造模时肝组织损伤较明显，血清中ALT、AST水平显著增高，炎症因子的释放明显增多，且24h内不会造成小鼠死亡，是ALI较合适的造模浓度；ConA造模后血清5-HT水平明显升高；
2.TPH1-/-小鼠体内5-HT水平明显缺乏，而补充5-HTP可恢复5-HT水平；
3.5-HT可增加亚致死剂量ConA(25mg/kg)作用下小鼠5d的死亡率；
4.在ConA肝损伤中，5-HT可增加小鼠血清中ALT、AST水平，并加重肝脏病理损伤程度，促进血清中IL-2、IL-6、IL-17A、IFN-γ及TNF-α等炎症因子的释放；
5.在ConA肝损伤中，5-HT可增加肝组织内MDA、MPO及NO的含量，降低GSH的含量，加重氧化应激损伤；
6.在ConA肝损伤中，5-HT可促进肝组织内促凋亡因子Bax的表达，降低抗凋亡因子Bcl-2的表达，进而促进肝细胞凋亡；
7.在ConA肝损伤中，5-HT可能通过激活HMGB1-TLRs及下游MyD88/IRAK1/TRAF6/NF-κB通路，促进肝内炎症因子的释放，加重炎症反应；
8.ConA造模后肝组织内5-HT2A受体的表达明显增多，而5-HT2B受体无明显变化；5-HT2A受体拮抗性药物酮色林可通过抑制氧化应激损伤、肝细胞凋亡及抑制HMGB1-TLRs通路等途径减轻ConA诱导的肝损伤，提示5-HT可能通过5-HT2A受体加重ConA肝损伤。
9.在ConA诱导的肝纤维化中，5-HT可能增加小鼠血清中ALT、AST水平，加重肝组织病理损伤程度，促进胶原沉积，增加肝组织内α-SMA及TGF-β1的表达。
结论：
1.5-HT可能加重ConA诱导的肝损伤。
2.5-HT可能通过5-HT2A受体促进肝组织氧化应激损伤、肝细胞凋亡及激活HMGB1-TLRs通路，最终加重ConA肝损伤，而5-HT2A受体拮抗剂酮色林可能通过抑制上述过程减轻ConA肝损伤。
3.5-HT可能促进ConA慢性刺激所致的肝纤维化。
急性肝损伤(acute liver injury，ALI)是危害人类健康的常见疾病，主要由病毒感染、肝毒性药物、免疫等因素引起。严重或持续的肝损伤最终可导致肝功能衰竭或进展为慢性肝病、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。目前，ALI的发病机制尚不完全清楚，需要更多的理论支持。而对人类ALI发病机制的研究与治疗药物的筛选，在很大程度上依赖于良好的动物模型的建立和应用。刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)诱导的ALI及肝纤维化的病变过程可能与炎症反应、免疫反应、氧化应激、TLRs通路激活等相关，因而与人类免疫性肝炎及肝纤维化的病理机制较为接近，被学者们广泛应用。
5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是一种经典的神经递质，有中枢及外周源性两种，其中外周型约占95%。色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase，TPH)是合成5-HT的关键酶，有TPH1和TPH2两种形式，分别调节外周和中枢型5-HT。既往研究表明，外周型5-HT在消化系统疾病、炎症反应、免疫反应、代谢等过程中均发挥着重要作用。最新的基础与临床研究也发现，外周型5-HT可参与病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝、肝纤维化及肝癌等多种肝脏疾病的病理过程。其机制可能与5-HT调节炎症反应、氧化应激等有关。然而，有关外周型5-HT在ConA诱导的肝损伤中的作用，目前尚无文献报道。
目的：
既往研究表明，5-HT在肝脏的生理病理过程中发挥着双刃剑的作用。一方面，5-HT有利于肝切除术后的肝再生；另一方面，5-HT还可能加重非酒精性肝病、肝纤维化、肝癌等疾病的进展。本课题旨在探讨：1)5-HT在ConA诱导的ALI中的作用及可能的机制；2)5-HT通过何种受体发挥作用及通过干预该受体改善ConA肝损伤的可行性；3)5-HT在ConA诱导的肝纤维化中的作用。
方法：
1.首先，为了寻找较合适的造模浓度，我们分别给予野生型(wild-type，WT)C57BL/6小鼠单次尾静脉注射不同浓度的ConA(8mg/kg、15mg/kg及25mg/kg三个浓度)，以制造不同程度的ConA肝损伤模型，比较各组小鼠的肝损伤情况及24h死亡率；全自动生化分析仪检测造模后谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)及谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平的变化；然后利用ELISA试剂盒动态监测造模后小鼠血清中5-HT水平及炎症因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ及TNF-α的变化；
2.然后我们进一步探讨5-HT在ConA肝损伤中的作用及可能的机制。我们将小鼠分为5组：WT小鼠对照组(WT+NS)和造模组(WT+ConA)，TPH1敲除小鼠(体内5-HT缺乏)对照组(TPH1-/-+NS)和造模组(TPH1-/-+ConA)，以及TPH1敲除小鼠补充5-羟色胺酸(5-hydroxytryptophane，5-HTP，为5-HT的前体，可恢复体内5-HT)恢复5-HT后造模组(TPH1-/-+5-HTP+ConA)。造模成功后取各组小鼠的血液及肝脏组织。利用ELISA试剂盒验证各组小鼠血清中基础5-HT的水平的差异；利用上述分组的方法，给予各组小鼠以亚致死剂量的ConA尾静脉注射，观察并比较其5d的生存情况；全自动生化分析仪检测比较小鼠血清中转氨酶水平；HE染色比较肝组织的病理损伤程度；ELISA试剂盒检测血清中炎症因子的水平；qRT-PCR检测肝组织内炎症因子mRNA水平；利用试剂盒检测比较肝组织中氧化应激相关指标谷胱甘肽(glutathione，GSH)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、一氧化氮(nitric oxide，NO)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的含量；利用westernblotting的方法检测肝组织内凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白的表达情况；Tunel染色比较肝细胞的凋亡程度；通过westernblotting检测肝组织内HMGB1、TLR2、TLR4、TLR9及下游分子MyD88、IRAK1、TRAF6及NF-κB蛋白的表达水平
3.然后我们分析了5-HT通过何种受体发挥作用。我们首先检测了造模后肝内5-HT2A和5-HT2B受体的变化情况，然后探讨与ConA肝损伤相关的5-HT2A受体的拮抗性药物酮色林能否改善ConA肝损伤。我们将WT小鼠分为3组：对照组(NS)、造模组(ConA)及造模的同时腹腔注射酮色林组(ConA+ketanserin)。首先通过westernboltting验证酮色林能否降低小鼠肝组织内的5-HT2A受体；然后我们采用上一部分的实验方法，分别探讨在ConA肝损伤中，酮色林能否减轻小鼠肝功能损伤、肝组织病理损伤、氧化应激损伤、肝细胞凋亡，能否抑制HMBG1-TLRs通路及减轻炎症反应。
4.最后我们初步探讨了5-HT在ConA慢性刺激致肝纤维化中的作用。该部分中，我们将小鼠分为四组：WT小鼠对照组及造模组(造模方法：ConA12mg/kg,1次/w，连续8w)，TPH1-/-敲除小鼠对照组及造模组。造模成功后取各组小鼠的血液及肝脏组织。利用ELISA试剂盒动态监测造模后小鼠血清中5-HT水平的变化；全自动生化分析仪检测比较小鼠血清中ALT和AST水平；HE染色比较肝组织的病理损伤程度；SiriusRed染色比较肝组织内胶原纤维的含量；进一步通过试剂盒检测肝组织内羟脯氨酸的含量，比较胶原蛋白的水平；最后通过westernblotting比较各组肝组织内α-SMA及TGF-β1的表达水平。
结果：
1.15mg/kg的ConA造模时肝组织损伤较明显，血清中ALT、AST水平显著增高，炎症因子的释放明显增多，且24h内不会造成小鼠死亡，是ALI较合适的造模浓度；ConA造模后血清5-HT水平明显升高；
2.TPH1-/-小鼠体内5-HT水平明显缺乏，而补充5-HTP可恢复5-HT水平；
3.5-HT可增加亚致死剂量ConA(25mg/kg)作用下小鼠5d的死亡率；
4.在ConA肝损伤中，5-HT可增加小鼠血清中ALT、AST水平，并加重肝脏病理损伤程度，促进血清中IL-2、IL-6、IL-17A、IFN-γ及TNF-α等炎症因子的释放；
5.在ConA肝损伤中，5-HT可增加肝组织内MDA、MPO及NO的含量，降低GSH的含量，加重氧化应激损伤；
6.在ConA肝损伤中，5-HT可促进肝组织内促凋亡因子Bax的表达，降低抗凋亡因子Bcl-2的表达，进而促进肝细胞凋亡；
7.在ConA肝损伤中，5-HT可能通过激活HMGB1-TLRs及下游MyD88/IRAK1/TRAF6/NF-κB通路，促进肝内炎症因子的释放，加重炎症反应；
8.ConA造模后肝组织内5-HT2A受体的表达明显增多，而5-HT2B受体无明显变化；5-HT2A受体拮抗性药物酮色林可通过抑制氧化应激损伤、肝细胞凋亡及抑制HMGB1-TLRs通路等途径减轻ConA诱导的肝损伤，提示5-HT可能通过5-HT2A受体加重ConA肝损伤。
9.在ConA诱导的肝纤维化中，5-HT可能增加小鼠血清中ALT、AST水平，加重肝组织病理损伤程度，促进胶原沉积，增加肝组织内α-SMA及TGF-β1的表达。
结论：
1.5-HT可能加重ConA诱导的肝损伤。
2.5-HT可能通过5-HT2A受体促进肝组织氧化应激损伤、肝细胞凋亡及激活HMGB1-TLRs通路，最终加重ConA肝损伤，而5-HT2A受体拮抗剂酮色林可能通过抑制上述过程减轻ConA肝损伤。
3.5-HT可能促进ConA慢性刺激所致的肝纤维化。