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研究背景:卵巢癌是女性生殖系统死亡率最高的恶性肿瘤,多数患者就诊时已为晚期,预后较差。紫杉醇类+铂类为主的标准化疗将卵巢癌患者的5年生存率提高至30%,尽管靶向药物PARP酶抑制剂为携带同源重组缺陷的患者（约占50%）带来更多生存机会,但近一半的患者暂时仍然无法从中获益,探索新的治疗方案和手段仍然非常必要。维生素B6家族作为人体必需微量元素,磷酸吡哆醛作为公认的唯一的维生素B6活性形式,在200余种酶促反应中利用其磷酸酯基团与靶蛋白结合,并利用其吡哆环上的醛基发挥辅酶作用,而肿瘤相关研究中对于维生素B6的研究也以PLP作为干预及观察指标。本课题在前期研究基础上,以维生素B6家族的另一个成员吡哆醛（PL）为研究核心,探究了吡哆醛原型在卵巢癌中是否具有生物学活性及其潜在机制。研究方法:（1）RTCA及CCK-8法比较吡哆醛PL与磷酸吡哆醛PLP对卵巢癌细胞的抑制效应;设计并构建取代了磷酸酯基团的生物素-吡哆醛Biotin-PL,并通过RTCA检测Biotin-PL对卵巢癌的抑制效应。（2）通过RTCA、2D及3D克隆形成、裸鼠原位成瘤检测吡哆醛PL对卵巢癌细胞的抑制效应;通过Ed U及细胞周期测定检测吡哆醛是否影响细胞增殖;通过Caspase3/7活性测定、Annexin V/PI双染、碱性彗星尾实验、核膜渗透实验检测吡哆醛是否影响细胞凋亡;通过对原位移植瘤灶免疫荧光染色Cleaved-PARP1及Ki-67,验证体内实验中吡哆醛PL对卵巢癌增殖及凋亡的影响。（3）通过蛋白组学和代谢组学分析吡哆醛处理卵巢癌细胞株SKOV3 48小时后细胞内蛋白表达及代谢活动发生的改变;MRM靶向蛋白质组学验证SKOV3细胞内受PL影响的多种蛋白质的表达水平;Nile Red染色验证细胞内脂质含量的变化;MDA及Fe3+探针检测细胞内铁死亡水平;线粒体靶向荧光染料检测线粒体形态、膜电位、m PTP开放程度以及线粒体密度;透射电镜检测细胞内脂滴、线粒体的形态及数目;MDC标记自噬小体检测细胞自噬水平;线粒体及溶酶体共定位检测线粒体自噬活性。（4）通过DCFH-DA荧光探针检测吡哆醛PL处理细胞及原位瘤体内ROS水平;半乳糖苷酶染色检验吡哆醛PL对细胞衰老程度的影响;还原剂处理细胞后,RTCA检测细胞对吡哆醛PL敏感性的改变、检验细胞内ROS含量及Caspase3/7活性;Mito-Tracker Red验证还原剂及吡哆醛PL对线粒体形态的影响。（5）提取纯化线粒体后,Amplex Red探针检测线粒体及完整细胞的过氧化氢生成速率;Mito-SOX原位标记检测线粒体内O2-水平;线粒体靶向还原剂Mito-Tempo处理细胞后,RTCA检测细胞对吡哆醛PL的敏感性;PEX5免疫荧光及活细胞过氧化物酶体荧光探针转染检测PL处理对细胞内过氧化物酶体数目的影响;利用过氧化氢酶活性试剂盒检测吡哆醛PL处理对细胞内过氧化氢酶活力的影响。（6）通过Biotin-Streptavidin Pull Down联合SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色筛选吡哆醛PL潜在的互作蛋白,免疫荧光验证吡哆醛PL处理对PPARα亚细胞定位的影响,Auto-Docking模拟吡哆醛PL与PPARα之间的分子-蛋白互作的空间构象,并通过Biotin-Streptavidin共沉淀及荧光共定位验证吡哆醛PL与PPARα之间的互作;q RT-PCR及荧光半定量法检测吡哆醛PL对细胞内PPARα的蛋白质及m RNA表达水平的影响。（7）构建稳定过表达或敲低PPARα的卵巢癌细胞系,免疫荧光半定量检测PPARα表达水平对细胞内过氧化物酶体数目的影响;PPARα特异性抑制剂GW6471处理后,检测细胞对PL的敏感性、ROS水平、Caspase3/7活性和ATP合成效率,Nile Red检测细胞内脂滴形态及脂质含量;饥饿诱导PPARα活化后,RTCA检测细胞对PL的敏感性;利用Kaplan-Meier plotter公共数据库分析卵巢癌组织中PPARα、PEX11α的m RNA表达水平与患者预后的相关性。结果:（1）RTCA及CCK-8法测定发现PL对卵巢癌细胞的抑癌效应比PLP更强,且保持非磷酸化状态的Biotin-PL依然具有抑癌效应。RTCA提示PL以浓度依赖的方式对卵巢癌细胞发挥抑制效果。（2）体内、体外成瘤实验提示吡哆醛PL显著抑制了卵巢癌细胞的成瘤能力,但Ed U、细胞周期检测提示PL并未干预细胞周期,流式细胞学及碱性彗星尾、核膜渗透实验表明细胞内Caspase3/7活性升高,DNA断裂增加及核膜完整性受损,提示PL诱导细胞凋亡。（3）蛋白质组学和代谢组学提示吡哆醛PL处理抑制了线粒体呼吸链功能,细胞内脂肪酸氧化代谢和三羧酸循环受阻,Nile Red染色验证了细胞内脂质蓄积,线粒体功能及结构荧光探针提示线粒体形态、膜电位及m PTP开放程度均有所改变,线粒体自噬水平不足,细胞内出现受损线粒体蓄积。（4）ROS荧光探针及RTCA实验提示PL处理导致细胞内氧化应激,且还原剂可逆转PL诱导的氧化应激、线粒体水肿及细胞凋亡。过氧化氢探针及原位O2-探针检测发现PL诱导的氧化应激起源于线粒体外,Cell Light活细胞Tracker示踪提示PL处理可诱导过氧化物酶体增殖,荧光共定位及CAT活性检测验证了过氧化物酶体中CAT缺失及细胞CAT活性下降,过氧化物酶体产生ROS。（5）Biotin-Streptavidin Pull Down联合质谱提示PPARs可能是PL在细胞内的直接靶点,免疫荧光及q RT-PCR检测PPARα靶基因的表达水平验证了PL对PPARα的激活作用,分子-蛋白docking模拟PL-PPARα之间的分子互作及结合位点,Biotin-Streptavidin co-precipitation验证PL-PPARα在细胞内的直接互作。（6）过表达PPARα可增加细胞内过氧化物酶体数目,且无论是过表达PPARα、还是饥饿诱导PPARα激活,均能增加细胞对PL的反应性。而敲低PPARα或使用特异性抑制剂处理细胞,可减轻PL诱导的氧化应激和线粒体损伤,增加细胞对于PL的耐受。结论:（1）在四种卵巢癌细胞株中,PL均表现出较PLP更强的抑癌效应,且PL可以不依赖磷酸化形式诱导细胞凋亡而发挥体内、体外抑癌效应,但对细胞周期、衰老、铁死亡及坏死水平并无显著影响。（2）吡哆醛处理导致卵巢癌细胞株中线粒体呼吸链功能障碍,与其耦连的三羧酸循环和脂肪酸氧化过程受阻滞,ATP合成能力受损,线粒体膜通透性转换孔持续开放,膜电位下降,最终发生细胞凋亡。（3）吡哆醛PL可能通过其醛基与PPARα互作并激活其转录因子活性,诱导过氧化物酶体增殖,激活过氧化物酶体中脂肪酸氧化（FAO）过程。过氧化物酶体FAO过程产生的ROS及抗氧化蛋白CAT的缺失导致过氧化物酶体成为ROS的生产者,发生氧化应激,影响线粒体呼吸链功能。