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阿尔茨海默病的β淀粉样蛋白学说认为:大脑海马、新皮质和基底前脑等脑区神经元在病理状态下淀粉样蛋白产生增加,这些高浓度的淀粉样蛋白倾向于形成寡聚体,寡聚体进一步聚集形成难溶性的淀粉样蛋白斑块,对神经元产生多方面的毒性作用,包括产生炎症反应、导致tau蛋白异常磷酸化、损害学习记忆、产生神经元缺损、破坏神经网络等,从而引发阿尔茨海默病的一系列症状。β淀粉样蛋白是由淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)经β分泌酶和γ分泌酶水解剪切形成。APP基因转录后加工剪接主要形成3种同源体,分别为APP695、APP751、APP770,脑组织中主要是APP695。近年来不少的研究发现,激动中枢神经元烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)可以减少β淀粉样蛋白产生,增强认知和学习记忆功能。神经元烟碱受体被认为是治疗阿尔茨海默病药物开发的新靶点。在中枢神经系统共分布有9种不同的nAChR亚型,其中以α4β2亚型分布最为广泛。本研究以α4β2 nAChR亚型受体为研究对象,在已经稳定表达外源α4β2受体基因的人神经母细胞瘤来源的SH-EP1细胞中,稳定转染人APP695基因,建立共表达α4β2 nAChR和APP695的SH-EP1-α4β2 nAChR -APP695细胞模型。在此细胞模型观察α4β2亚型受体激动对淀粉样蛋白的影响及其机制;在机制研究的基础上,建立BACE1基因启动子活性分析的方法,以期能找到可以用于亚型特异性抗阿尔茨海默病药物高通量筛选的细胞模型。首先用脂质体转染的方法在已经稳定表达外源α4β2 nAChR基因的SH-EP1细胞转染APP695基因,获转染后细胞单克隆共36株。用RT-PCR的方法鉴定APP695在这36株单克隆中的表达,挑选出16株细胞克隆有APP695 mRNA表达;进一步从这16株表达APP695的细胞株中,挑选出4株同时表达烟碱α4亚单位mRNA和β2亚单位mRNA。用Western blotting鉴定这4株细胞克隆APP695蛋白的表达,其中一株编号为1C8的细胞克隆有较高APP695蛋白表达。用膜片钳鉴定1C8细胞克隆株上α4β2 nAChR受体功能,发现给予100μM烟碱,细胞膜出现内向电流,证实细胞膜上的α4β2 nAChR受体功能正常存在。这样,本研究就成功建立了稳定共表达α4β2 nAChR和APP695的SH-EP1-α4β2 nAChR-APP695细胞模型。在SH-EP1-α4β2 nAChR-APP695细胞模型进行相关受体活性化合物实验,给予烟碱受体激动剂烟碱(0.1μM、1μM)和α4β2亚型特异性激动剂epibatidine(0.1μM),以及α4β2亚型特异性拮抗剂DHβE(1μM)。用Western blotting和ELISA检测化合物干扰前后细胞内和细胞外Aβ水平的变化,发现烟碱(1μM)和epibatidine(0.1μM)可以降低细胞内外β淀粉样蛋白水平,拮抗剂DHβE(1μM)可以逆转烟碱和epibatidine对β淀粉样蛋白的下调作用。进一步探讨α4β2亚型受体激动对β淀粉样蛋白影响的机制,用荧光定量PCR的方法检测药物对APP的mRNA水平以及相关蛋白β分泌酶BACE1、γ分泌酶PSEN1亚基以及MAPK信号转导通路的ERK1和NFκB P65亚基mRNA水平的影响,结果显示α4β2亚型受体激动不改变APP的mRNA水平,能够显著降低β分泌酶BACE1、γ分泌酶PSEN1亚基以及ERK1、NFκB P65亚基mRNA水平。这些结果提示:烟碱α4β2体激动后通过抑制MAPK- NFκB信号转导通路发挥作用。本研究的另一个目的,是在SH-EP1-α4β2 nAChR-APP695细胞模型探索用双荧光素酶报告基因系统进行基因启动子活性分析,寻找亚型特异性药物筛选的简便快捷方法。首先用Bgl II和Hind III限制性内切酶将用β分泌酶BACE1、γ分泌酶PSEN1亚基基因启动子片段克隆进pGL3-BASIC质粒。然后用脂质体的方法把构建的重组质粒pGL3-PSEN1-918, pGL3-BACE1-757, pGL3-BACE1-1876, and pGL3- BACE1-2000转染进SH-EP1-α4β2 nAChR-APP695细胞。用双荧光素酶报告基因分析的方法,检测α4β2 nAChR激动对β分泌酶BACE1、γ分泌酶PSEN1基因启动子活性是否有影响。实验结果发现α4β2 nAChR激动可以影响β分泌酶BACE1基因启动子片段的活性,因此BACE1基因启动子活性检测可以作为在此细胞模型进行快捷节省的亚型特异性药物筛选的一个方法。总结:1、本研究成功建立了稳定共表达APP695和nAChRα4β2受体的细胞系。在此基础上通过受体活性化合物试验发现nAChRα4β2亚型受体激动可以降低细胞β淀粉样蛋白水平,提示选择性中枢烟碱α4β2亚型受体激动可能对防治阿尔茨海默病具有积极意义。2、中枢烟碱α4β2亚型受体激动导致β淀粉样蛋白降低可能是通过作用于MAPK-NFκB信号转导通路进而降低β分泌酶BACE1、γ分泌酶PSEN1亚基mRNA水平实现的。3、在共表达细胞系上基于BACE1基因启动子的活性分析可以作为亚型特异性药物高通量筛选方法。