冠心病、心肌梗死等缺血性心脏病是一种病势凶险、死亡率较高的全球性疾病。由于心肌细胞是终末分化细胞不能再生,因此,当发生心肌梗死后,心肌细胞坏死、凋亡造成细胞数目减少,心肌细胞只能由成纤维细胞填充,坏死的心肌则由瘢痕组织取代,并逐步发生心室重构导致心脏收缩功能下降以至发生顽固性心力衰竭。目前心肌梗死后的治疗手段主要包括药物治疗、介入治疗和手术治疗。中医药治疗缺血性心脏病,临床辫证多属于胸痹、心痛范畴。因证论治可在一定程度上缓解或解除患者的临床症状,但单纯中药治疗仍不能在短时间内补充缺乏的心肌细胞,也就无法从根本上治愈患者。因此人们仍在不断寻找新的治疗方法,期望能使坏死的心肌细胞得以修复或再生,干细胞移植便成为了国内外研究的热点。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一类具有自我更新和多分化潜能的细胞,这些特性决定其可以在体外增殖生长,在特定的细胞因子和诱导剂的作用下分化成各种功能细胞。BMSCs在一定的诱导条件下可定向分化为心肌细胞,目前大多数研究者采用的是5-氮胞苷对其进行诱导,而临床上常用的治疗心血管疾病的中药作为诱导剂也逐渐成为人们关注的对象。丹参在临床上广泛用于治疗心血管系统疾病,其主要化学成分包括以丹酚酸B (salvianolic acid B, Sal B)为代表的水溶性酚酸类化合物和以丹参酮ⅡA为代表的醇溶性菲醌类化合物。丹参的水溶性成分以抗氧化作用等突出；脂溶性成分以抗菌、抗炎等作用更显著。这种作用的多样性正是丹参具有广泛适应症的基础。本实验采用中药丹参的有效成份Sal B及丹参酮ⅡA作为诱导剂体外诱导BMSCs向心肌细胞分化,观察分化过程中细胞形态的变化和特异基因的表达,同时从形态学、蛋白表达等多层面比较联合应用诱导剂是否较单独应用一种诱导剂更有利于细胞的分化,从而探索体外BMSCs诱导分化为心肌细胞的新方法。用2周龄健康SD大鼠28只,雌雄不限,体重15-30g,颈推脱臼法处死,75%酒精中浸泡10mmin。将大鼠移至无菌操作间内,用经高压蒸汽灭菌的器械快速取胫骨和股骨,去除周围组织,切除胫骨和股骨两端,放入含有D-Hanks液/双抗(青霉素100mg/L,链霉素100g/L)的缓冲液中冲洗2次。另取一套无菌器械去除长骨骨骺端显露骨髓腔,用培养液将骨髓腔中的骨髓冲出后收集离心,1500r/min离心5min,弃上清液。加入含1O%胎牛血清的IMDM培养基反复吹打,取一滴细胞悬液加入10μ10.04%锥虫蓝混匀,血细胞计数板计数活细胞,以1×1014/L密度接种于培养瓶中,置于37℃,5%C02的培养箱中培养。12h后半量换液,轻柔操作,仔细观察细胞贴壁情况,至24h完全更换培养基。24h后换液,此后每3d换液1次,贴壁细胞达90%融合时用0.5%trypsin和0.04%EDTA(1:1)消化,以1：2接种传代。为了确定分离得到的细胞是否为BMSCs,以免疫细胞化学法鉴定细胞的表面标志。选取第4代生长良好、形态均一并接近90%融合的细胞制备细胞爬片,以40g/L多聚甲醛固定后行免疫细胞化学法染色,鉴定细胞表面标志CD29及CD34。为了了解大鼠BMSCs的生长特点,描记其生长曲线。选取第2、4、6代生长良好、形态均一并接近90%融合的细胞以1×107/L的密度接种于24孔板,每24h消化3孔细胞并计数并绘制曲线图。以生长良好、形态均一的第2代大鼠BMSCs为实验对象,培养48h后分为四组分别加入含Sal-B、tanshio ⅡA、Sal-B+tanshio ⅡA的诱导培养基和作为空白对照的普通生长培养基。诱导分化3d后换用普通生长培养基,常规培养28d。选取诱导后培养至28天生长旺盛、形态均一的细胞制备细胞爬片,40g/L多聚甲醛固定,HE染色观察细胞形态,SP法进行免疫细胞化学染色检测desmin、α-sarcomeric actin、cTnT及Cx43心肌样细胞标志物；免疫荧光染色观察细胞中desmin和cTnT两种标志物共表达的情况。实验结果倒置相差显微镜下观察到：接种到培养瓶中的原代细胞,多单个圆球形漂浮于培养瓶内；24h后细胞开始贴壁,部分细胞形态伸展、体积增大,贴附于瓶壁,换液逐渐去除未贴壁细胞。5d后可见部分贴壁细胞形态逐渐变为纺锤形或梭形,并伸出伪足相互连接。1周左右细胞长满瓶底,细胞体积进一步增大,形态更加多样化。9～11d细胞渐渐铺满培养瓶,进行传代。4代左右小原形的造血细胞基本随换液传代除净。鉴定结果显示分离得到的BMSCs细胞纤维连接受体CD29为阳性,造血干细胞标志CD34为阴性,说明其表达基质细胞抗原,不表达泛白细胞抗原,符合间充质干细胞的特点。细胞计数结果显示,分离得到的BMSCs在接种初24h基本未增殖；第2至3天生长缓慢；第4天生长速度开始加快,进入对数生长期；第7天细胞增值速度开始减慢,进入平台期。在各代细胞中生长规律相近。加入诱导剂诱导培养48h后,第2代细胞生长48h后加入诱导剂,随后细胞形态发生明显改变。各诱导组在诱导培养48h后细胞形态类似,细胞贴壁、伸展,周围伸出长短不一的突起,细胞可呈现扁平多角形、梭形等多种形态；丹酚酸B组在诱导7d时细胞以梭形、柱形为主,细胞形态变长,体积增大,大小不等,部分有分支,并互相连接。丹参酮ⅡA组诱导10d后细胞形态多为类长柱形,核卵圆形,位于中央。二者联合诱导组于诱导2w后开始出现细胞间连接,4w时细胞体积变小,呈条梭状排列,可见类肌管样结构,且细胞内可见有肌丝样结构。培养期间各组均未观察到明显的细胞跳动。空白对照组BMSCs则始终呈纤维细胞样外观,培养过程中形态不发生明显改变。免疫细胞化学结果显示,对照组细胞desmin、α-sarcomeric actin、 cTnT及Cx43均为弱阳性或阴性表达。各诱导组BMSCs均可见desmin、 a-sarcomeric actin、cTnT及Cx43阳性表达的细胞。统计结果显示,与对照组相比,丹酚酸B组,丹参酮ⅡA组,丹酚酸B+丹参酮ⅡA组BMSCs以上各标记物阳性表达均明显升高,且差异有统计学意义(P<0.01)。其中,二者联合诱导组各标记物的阳性率均最高。免疫荧光双标染色结果显示,细胞质内desmin的表达呈红色,cTnT的表达呈绿色,两者同时被观察到时,其重叠的部位为黄色。说明部分细胞只表达desmin,部分细胞只农达cTnT。大部分细胞同时表达两种标记物。大鼠BMSCs经过全骨髓贴壁分离法体外培养后增殖分化能力强,生长规律符合干细胞特征,可以诱导分化做为组织工程的“种子”细胞。体外培养的大鼠BMSCs经Sal-B、tanshio IIA及二者联合诱导后可定向分化为心肌样细胞。形态学观察、免疫细胞化学检测、荧光免疫细胞化学检测显示分化的心肌细胞具有早期心肌细胞的结构特征和标志物表达。免疫细胞化学染色后测得的细胞分化率结果提示在诱导大鼠BMSCs向心肌细胞分化过程中使用Sal-B与tanshio IIA联合诱导的效果明显优于二者分别单独诱导的作用效果。