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研究背景心肌梗死(Myocardial infarction, MI)导致心肌长期缺血后,心室可发生重塑,包括梗死区心肌坏死为瘢痕组织替代、非梗死区心肌细胞肥大、心肌间质纤维化、整个心室进行性的扩张和变形。心室重塑最终可导致心脏收缩功能降低,引起心力衰竭。目前认为心梗后导致心力衰竭的主要病理生理机制之一是心室重塑,防治心梗后的心室重塑已成为心力衰竭治疗方案中的一个重要环节。临床试验发现强化胰岛素治疗能有效降低心梗病人死亡率。我们前期研究发现胰岛素可直接激活“生存信号”磷脂酰肌醇三羟基激酶-蛋白激酶B-内皮型一氧化氮合酶(PI3Kinase-Akt-eNOS)信号途径,抑制缺血心肌细胞的凋亡,促进急性缺血心肌功能的恢复。然而,胰岛素对心肌梗死导致心肌长期缺血后心室重塑和心脏功能的影响目前尚不清楚。因此,本实验旨在观察胰岛素对大鼠心肌梗死后心室重塑和心脏功能的影响,并进一步探讨其作用机制是否与胰岛素激活“生存信号”抑制心肌细胞凋亡有关。研究目的1.观察胰岛素对大鼠心肌梗死后心室重塑和心脏功能的影响。2.探讨其作用机制是否与胰岛素激活“生存信号”抑制心肌细胞凋亡有关。实验方法永久结扎冠脉左前降支造大鼠心肌梗死模型。将大鼠随机分为以下4组:(1)假手术组(Sham);(2)对照组(Saline);缺血20分钟后通过尾静脉以4 ml/kg/h的速率输入生理盐水(0.9%NaCl)2小时,并在缺血后一周内每日皮下注射生理盐水1 ml/kg体重。(3)早期胰岛素治疗组(Early insulin treatment):缺血20分钟后通过尾静脉以4 ml/kg/h的速率输入50 U/L胰岛素2小时,并在缺血后一周内每日皮下注射0.5 U/ml胰岛素1 ml/kg体重;(4)晚期胰岛素治疗组(Late insulin treatment):缺血一周以后开始给予胰岛素治疗,剂量和方式与早期胰岛素治疗组相同。术后1周、4周和8周用超声测定左室收缩末期/舒张末期内径(LVESD/LVEDD),左室射血分数(EF)和左室缩短分数(FS)。术后4周测定左室发展压(LVDP)、左室最大收缩、舒张末压微分(±dP/dtmax)。HE染色测定心肌细胞横截面积(Cross-sectional area of cardiomyocytes),Masson染色检测心肌胶原容积分数(Collagen volume fraction)和心肌梗死面积(Infarct size,IS)。采用氯胺T法检测心肌组织羟脯氨酸(Hydroxyproline, Hyp)含量。应用TUNEL法检测非梗死区心肌细胞的凋亡,同时检测非梗死区心肌组织的caspase-3酶活性。为研究胰岛素心脏保护作用的机制,另取大鼠造心肌梗死模型,随机分为3组(1)正常对照组(Normal):未经任何处理的正常大鼠;(2)心梗1天组(MI 1 d):心梗模型建立并饲养1天后的大鼠;(3)心梗1周组(MI 1 wk):心梗模型建立并饲养1周后的大鼠。检测空腹血糖(FPG, Fasting plasma glucose)和血清胰岛素水平(FIN, Fasting plasma insulin),以及胰岛素刺激的非梗死区心肌组织氟脱氧葡萄糖(FDG)摄取。Western blotting测定胰岛素刺激的p-Akt、Akt及p-p38 MAPK、p38 MAPK水平。实验结果1.早期而非晚期的胰岛素治疗减轻心梗后的心脏损伤,改善心脏功能:与对照组(Saline)相比,早期胰岛素治疗组术后1周、4周和8周LVEF(60.3±3.4% vs. 47.9±2.3%, n=8-11, P<0.05; 65.4±3.1% vs. 48.1±2.1%, n=8-11, P<0.01; 63.1±4.2% vs. 44.2±4.3%, n=8-11, P<0.01)和LVFS(33.07±4.0% vs. 20.9±2.2%, n=8-11, P<0.05; 31.4±3.2% vs. 20.1±2.1%, n=8-11, P<0.05; 30.1±2.9% vs. 19.1±2.1%, n=8-11, P<0.05)明显升高,术后4周LVDP(135±5 vs. 114±4 mmHg, n=6, P<0.05)和±LV dP/dtmax(2837±149 vs. 2234±146 mmHg·s-1, n=6, P<0.05; 2782±152 vs. 2134±162 mmHg·s-1, n=6, P<0.05)显著升高,心肌梗死面积明显减小(30.2±2.5% vs. 45.2±2.6%, n=6, p<0.05)。上述结果晚期胰岛素治疗组与对照组相比无明显差异。提示,早期胰岛素治疗可减轻心梗后的心脏损伤,改善心脏功能,而晚期胰岛素治疗的保护效果明显减弱。2.早期而非晚期的胰岛素治疗改善心梗后的心室重塑:与对照组(Saline)相比,早期胰岛素治疗组术后1周、4周和8周LVESD明显增大(0.43±0.02 vs. 0.55±0.03 cm, n=8-11, P<0.05; 0.40±0.02 vs. 0.54±0.03 cm, n=8-11, P<0.05; 0.42±0.02 vs. 0.60±0.04 cm, n=8-11, P<0.05),术后4周心肌胶原含量(20.3±1.7 vs. 27.7±1.7 mg/g myocardium, n=6, P<0.05)和胶原容积分数(6.38±0.63% vs. 9.18±0.61%, n=6, P<0.05)均明显降低。上述结果晚期胰岛素治疗组与对照组相比无明显差异。可见,早期胰岛素治疗可改善心梗后的心室重塑,而晚期胰岛素治疗延缓心梗后的心室重塑的效果明显降低。3.早期而非晚期的胰岛素治疗减少长期缺血后心肌细胞的凋亡:与对照组(Saline)相比,早期胰岛素治疗组术后4周非梗死区心肌细胞凋亡指数(8.24±1.29% vs. 15.32±1.36%, n=3, P<0.05)和caspase-3活性(1.60±0.22 vs. 2.70±0.21, n=3, P<0.05)明显降低,而晚期胰岛素治疗组细胞凋亡指数和caspase-3活性无显著性改变。结果提示,早期胰岛素治疗可减少长期缺血后心肌细胞的凋亡,而晚期胰岛素治疗则无明显抗凋亡效应。4.心肌梗死1周后全身胰岛素敏感性正常,心肌出现胰岛素抵抗:与正常对照组相比,心梗1天和1周后FPG、FIN和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)均无明显变化(n=6, P>0.1)。心梗1周组胰岛素刺激下的标准摄取值(SUV)较正常对照组和心梗1天组均明显降低(3.48±0.79 vs. 18.80±1.06 vs. 13.11±2.68, n=6, P<0.01)。结果提示,心梗1周后全身胰岛素敏感性变化不显著,而出现明显的心肌胰岛素抵抗。5.心梗早期胰岛素刺激可增加Akt磷酸化,抑制p38 MAPK磷酸化,而心梗晚期的胰岛素刺激则增加p38 MAPK磷酸化,激活Akt磷酸化的效果明显降低:正常对照组和心梗1天组胰岛素刺激下心肌p-Akt的表达较无胰岛素刺激时明显增加(n=3, P<0.01),而心梗1周组胰岛素刺激下心肌p-Akt的表达与无胰岛素刺激时比较无明显差异(n=3, P>0.1)。心梗1天后的胰岛素刺激与无胰岛素刺激时比较明显降低心肌p-p38 MAPK的表达(n=3, P<0.01),而心梗1周后的胰岛素刺激下心肌p-p38 MAPK的表达与无胰岛素刺激时比较明显增加(n=3, P<0.01)。结果提示,心梗早期胰岛素刺激可增加Akt磷酸化,抑制p38 MAPK磷酸化,而心梗晚期的胰岛素增加Akt磷酸化的效果明显降低,却可显著增加p38 MAPK磷酸化。结论1.早期胰岛素治疗治疗可抑制大鼠心梗后心肌细胞的凋亡,从而抑制心梗后的心室重塑、改善心梗后的心脏功能,而晚期的胰岛素治疗则无明显的心脏保护效果。2.早晚期胰岛素疗效差异的机制与心梗1周后出现心肌胰岛素抵抗有关,即早晚期胰岛素激活的信号通路发生转换:早期胰岛素治疗可激活PI3K-Akt“生存信号”,晚期胰岛素治疗则激活Akt明显减少,而显著激活p38 MAPK信号通路。