脑是人体对缺氧较为敏感的器官,严重缺氧能造成脑不可逆损伤,造成认知、语言、行动等能力的损害,甚至危及生命。缺氧最常见的形式是自然环境条件所致的氧缺乏和病理条件如缺血造成的氧缺乏,前者具有代表性的为高原环境中的缺氧,后者具有代表性的为缺血性缺氧。对缺氧造成的脑组织损伤而言,前者高原低氧环境中常因机体感染而诱发炎症反应累及脑组织,而缺氧的环境因素会进一步加剧该炎症反应,释放的细胞毒性物质又会通过级联放大效应加重脑组织损伤病变,我们称之为高原低氧炎症导致的脑损伤。而对于后者病理性氧缺乏造成的脑损伤而言,缺血性脑卒中为典型代表。缺氧导致以上两种脑损伤的分子机制主要包括缺氧加重组织炎症反应释放细胞毒性物质来损伤脑组织,及细胞能量代谢障碍加重脑组织细胞坏死等。WIP1作为机体内重要的磷酸酶,可以通过直接去除p38和NF-κB等重要信号分子的关键位点磷酸化来减缓炎症反应,并且还可以通过调控p53磷酸化失活和泛素化降解来诱导p53突变,发挥抗细胞死亡及促存活的功能。因此,我们推测WIP1可能通过介导脑组织中的炎症反应与神经细胞坏死来调控缺氧脑损伤过程。基于以上线索,本研究中我们主要探讨了WIP1基因在高原低氧炎症导致的脑损伤及缺血性脑损伤中的功能,我们的结果和发现主要包括以下三个方面:。一、建立了一种模拟高原低氧炎症导致脑损伤的小鼠模型以往高原条件的模拟通常采用高原现场实验法、低氧混合气体呼入法等,建模对象多为大型实验动物如大鼠、兔、犬、小型猪及牦牛等,但受制于成本、条件,开展实验有一定的困难,也难于管理控制。本研究选用应用最为广泛的实验动物之一——C57BL/6小鼠作为建模对象,利用低压低氧舱模拟海拔6000米处的高原低氧环境,采用腹腔注射低剂量LPS诱导炎症反应,成功建立了一种能在平原地区有效、稳定模拟高原低氧炎症导致脑损伤的小鼠模型。我们对该小鼠模型的评价结果显示:1.外周循环中炎症相关因子上调显著:经ELISA检测,小鼠血清中促炎因子IL-6、TNF-α及抑炎因子IL-10的水平均发生显著的升高。2.脑组织结构出现病理性改变:小鼠皮层和海马部位发生细胞肿胀、细胞间隙增宽及核固缩深染等明显组织损伤现象。此外我们首次发现,与皮层及海马两个脑区相比,丘脑腹后核群区损伤更为严重,出现细胞排列紊乱现象。3.脑组织出现了代偿性血管增生现象:利用CD31免疫荧光标记技术,我们检测到建模小鼠脑内皮层、海马及丘脑腹后核群区部位出现不同程度上的CD31表达上调,显示在模拟高原低氧联合LPS处理后,血管出现增生、新生以代偿性地抵抗高原低氧炎症导致的脑损伤。4.小鼠运动认知行为能力显著降低:高原低氧炎症导致脑损伤后,利用小鼠自发活动视频轨迹分析系统和小鼠新物体识别系统检测到,小鼠运动认知行为能力显著受损。小鼠是应用最为广泛的实验动物之一。近些年来,基因工程小鼠模型已经成为生物医学领域中重要研究工具和模式生物,因此,我们建立的模型有望广泛应用在低氧炎症脑损伤领域,并为相关研究提供便利。二、揭示wip1基因缺失加剧高原低氧炎症导致的小鼠脑损伤,明确了wip1基因在此病理损伤中具有神经保护作用。在前期成功建立的小鼠模型基础上,我们利用wip1敲除小鼠,在动物整体水平上研究并揭示了wip1对高原低氧炎症导致脑损伤的调控作用。我们的结果显示:模拟高原低氧联合lps处理后,1.wip1敲除小鼠外周循环中炎症因子表达上调更为显著:经elisa检测,wip1敲除小鼠血清中促炎因子il-6、il-1β、tnf-α及抑炎因子il-10的表达上调的更为显著。2.wip1敲除小鼠脑组织中小胶质细胞活化更为明显:利用iba-1免疫组化染色实验检测到wip1敲除小鼠大脑皮层、海马及丘脑腹后核群区小胶质细胞活化程度明显高于其在野生型小鼠中的活化程度,提示wip1缺失会加剧该病理条件下小胶质介导的炎症反应。3.wip1敲除小鼠脑组织中炎症反应更为剧烈,相关炎症因子表达上调更为显著:经elisa检测,wip1敲除小鼠脑组织中促炎因子il-6、il-1β、tnf-α的表达上调更为显著,提示wip1缺失会加剧高原低氧脑组织炎症反应,进而可加剧脑组织损伤。4.wip1敲除小鼠脑组织结构损伤更为严重:脑组织he染色结果显示,wip1敲除小鼠显示出更为严重的脑组织损伤,皮层及海马部位出现的细胞肿胀、细胞间隙增宽、神经元皱缩伴随核固缩深染和丘脑腹后核群区细胞排列紊乱等现象更为明显,提示wip1缺失加重了高原低氧炎症导致的脑损伤,进而影响其运动及认知行为能力。5.wip1敲除小鼠运动认知行为能力损伤更为严重:高原低氧炎症导致脑损伤后,利用小鼠自发活动视频轨迹分析系统和小鼠新物体识别系统检测到,wip1敲除小鼠的自发活动能力及新物体识别能力均下降的更为明显,揭示wip1缺失会加重小鼠脑损伤后的运动及认知能力障碍。我们的研究揭示,wip1缺失后会显著地加重小鼠在高原环境中炎症诱发的脑损伤,影响其认知行为能力。这将为研究wip1在其它高原感染疾病和高原脑病中的作用提供新的借鉴意义。三、初步探讨了wip1基因在小鼠缺血性脑损伤中的作用,初步发现wip1有对抗缺血性脑损伤的功能。本研究分别从动物整体、细胞及分子三个层面对wip1在缺血性脑损伤中的作用进行了初步探索性研究。我们取得的结果有:1.发现了WIP1在脑组织缺血侧表达上调:我们通过制作小鼠永久性大脑中动脉闭塞(MACO)模型,并利用Western Blot实验检测到,WIP1在缺血侧的表达明显高于其在对照侧的表达。2.明确了WIP1在神经细胞中的表达谱:我们通过分选主要原代神经细胞并对其进行氧糖剥夺(OGD)处理体外模拟缺血刺激,观察WIP1在各种细胞中的表达变化。Western Blot实验结果显示,WIP1集中表达在原代小胶质细胞中,并且其在OGD处理后表达明显上调,在小胶质细胞系BV2中也得到了同样的结论。3.成功构建过表达WIP1基因的神经系统免疫细胞BV2稳定株:我们利用慢病毒包装技术,成功构建了过表达WIP1的BV2细胞稳定株,分别利用LPS和OGD刺激BV2细胞株对其炎症反应功能进行检测,ELISA实验结果显示,WIP1基因过表达可以显著的抑制促炎因子TNF-α的分泌,并且WIP1调控促炎因子TNF-α的释放初步表现出酶活依赖的特点。这些实验结果初步显示,WIP1在模拟缺血导致的炎症反应中发挥抑炎作用。4.WIP1敲除对小鼠永久性脑缺血损伤的影响:实验结果初步显示,WIP1具有一定的脑保护作用,WIP1缺失加重小鼠缺血后脑梗死体积。我们首次将WIP1与缺血性脑损伤进行关联,尤其是WIP1通过小胶质细胞调控缺血脑损伤过程的科学假设的提出,为后续详尽的研究工作找到了很好的切入点。综上所述,该研究明确了WIP1参与对缺氧炎症导致的脑损伤中的调节作用。WIP1缺失后显著地加重小鼠在高原缺氧和缺血性的脑损伤,以及相关炎性细胞因子的显著上调。提示了WIP1是调控缺氧导致脑损伤这一病理过程的重要分子。本研究为缺氧性损伤和临床其它相关疾病的治疗提供了新的思路。