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微小RNAs(miRNAs)是一类大小约21～23个碱基的单链小分子RNA,在进化中高度保守,其表达既具有时空特异性,也具有组织和细胞特异性。miRNAs通过与mRNA的3端UTR序列互补而抑制其翻译,从而广泛地参与细胞生物学过程,包括发育、细胞增殖、分化、凋亡及代谢等。本实验室通过miRNA芯片技术发现骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向神经细胞分化后,miRNAs的表达谱发生明显改变,其中miR-29a的表达量较分化前增高最为明显。已有研究表明,miR-29a在胚胎期组织中不表达或低表达,但在生物体成熟组织细胞中广泛表达,也有研究发现miR-29a在肉瘤、胃癌、白血病等癌症中表达降低,提示miR-29a可抑制肿瘤细胞的增殖,促进凋亡。因此,我们推测miR-29a可能影响BMSCs的增殖分化过程并参与BMSCs的增殖分化调控。
间充质干细胞是来源于中胚层的成体干细胞,广泛存在于全身结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量最为丰富。BMSCs具有高度增殖、自我更新和多向分化潜能。BMSCs在特定的诱导条件下能分化为特定的成体细胞,同时丧失增殖能力和多向分化潜能,被认为是临床细胞替代治疗的理想细胞来源。但是,对BMSCs增殖特性的维持和分化调控机制尚不清楚。
本实验为了研究miR-29a对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响,用慢病毒介导miR-29a前体表达载体感染骨髓间充质干细胞,采用流式细胞仪测定miR-29a过表达和抑制时骨髓间充质干细胞的增殖与凋亡的变化,生物信息学分析miR-29a对骨髓间充质干细胞的增殖和凋亡的调控靶位点和机制,进一步探讨miR-29a对骨髓间充质干细胞的增殖和凋亡的影响。
目的：
通过调节miR-29a在BMSCs中的表达状态,观察miR-29a过表达和抑制时对BMSCs增殖和凋亡的影响,并分析其调控靶基因及作用机制。
方法：
1.慢病毒的包装和滴度测定。293T细胞复苏和扩增,分别用脂质体转染miR-29a前体表达病毒载体(eGFP)、miR-29a前体表达病毒对照载体(空白对照,eGFP)、miR-29a抑制剂病毒载体(mCherry)、miR-29a抑制剂病毒对照载体与包装载体(空白对照,mCherry),48 h收获病毒上清,分别为Lvx-miR-29a、Lvx-miR-29a-control、Lvx-miR-29a(-)、Lvx-miR-29a(-)-control,分别用病毒上清液感染293T细胞,流式细胞仪分别检测绿色或红色荧光细胞阳性率并计算病毒滴度。
2.慢病毒感染BMSCs。体外分离培养大鼠BMSCs,传代至第四代BMSCs用于病毒感染,分为Lvx-miR-29a组、Lvx-miR-29a对照组、Lvx-miR-29a(-)组和Lvx-miR-29a(-)-control对照组,分别加入Lvx-miR-29a、Lvx-miR-29a-control、Lvx-miR-29a(-)、Lvx-miR-29a(-)-control(MOI=10)来感染BMSCs,感染6 d后荧光倒置显微镜下观察绿色或红色荧光表达,荧光定量PCR检测各组miR-29a表达。
3.增殖和凋亡检测。慢病毒感染6 d后消化各组细胞进行流式细胞仪检测细胞周期与凋亡。
4.生物信息学分析。采用靶基因预测结合miRNA调控的基因表达谱分析:TargetScan6.0在线预测mo-miR-29a基因的可能靶基因,结合GEO数据库中miR-29调控的基因谱数据,筛选出miR-29可能下调的基因集合,进一步进行GO分析,筛选出于增殖或凋亡相关的基因。
5.统计学分析。采用SPSS12.0统计软件进行分析。独立实验重复3次,数值用样本均数±标准差(-X±S)表示,采用独立样本t检验比较两组间差异,以α=0.05为检验标准。
结果：
1.慢病毒的包装和滴度测定。293T细胞贴壁圆形、类圆形或多角形,排列整齐。包装病毒后第五天即传代后24 h在荧光倒置显微镜下看到带红色或绿色荧光蛋白的细胞,流式细胞仪也检测到带红色或绿色荧光蛋白的细胞,Lvx-miR-29a、Lvx-miR-29a-control、Lvx-miR-29a(-)、Lvx-miR-29a(-)-control四组的荧光细胞阳性率分别为47.8％、63%、59%及63%,分别计算Lvx-miR-29a、Lvx-miR-29a-control、Lvx-miR-29a(-)、Lvx-miR-29a(-)-control的病毒滴度,分别为7.17×107 IU/ml、9.45×107IU/ml、8.85×107 IU/ml、9.45×107IU/ml。
2.慢病毒感染BMSCs。体外分离培养大鼠的BMSCs至第四代,可以得到纯化的细胞,该细胞贴壁生长,呈梭形,旋涡状排列。病毒上清感染骨髓间充质干细胞48 h后荧光倒置显微镜下可看到带红色或绿色荧光蛋白的梭形,贴壁生长的细胞。感染4～5天后,细胞的荧光达到最强,5天后荧光无明显改变,转染效率约为60%。病毒感染后第6天用荧光定量PCR检测miR-29a的表达,结果显示:与对照组相比,Lvx-miR-29a组中miR-29a增高(5.62±1.86)倍,Lvx-miR-29a(-)组降低为(0.269±0.075)倍,差异有统计学意义(P＜0.05)。
3.增殖和凋亡的检测。与对照组相比,Lvx-miR-29a组的S期细胞明显减少,对照组和Lvx-miR-29a组处于S期的细胞分别占(17.41±3.78)%和(8.52±3.06)%(P＜0.05),增殖指数分别为(30.99±4.82)%和(19.75±5.22)%(P＜0.05)。流式细胞仪检测细胞凋亡:Lvx-miR-29a组和对照组(感染空载体)细胞的坏死率分别为(29.24±7.28)%和(14.34±4.33)%,凋亡率分别为(16.74±4.26%和(10.24±3.83)%;Lvx-miR-29a(-)和对照组(感染空载体)的细胞坏死率分别为(5.68±4.82)%和(15.56±3.78)%,凋亡率分别为(4.14±2.45)%和(6.91±2.52)%。显示miR-29a高表达促进BMSCs凋亡(P＜0.05)。
4.生物信息学分析。采用靶基因预测结合miRNA调控的基因表达谱分析,首先TargetScan6.0在线预测mo-miR-29a基因的可能靶基因(797个,保守区结合),miR-29a上调引起468个基因下调(GEO database no.GSE30525),同时满足上述两个条件的有58个基因(既是miR-29a靶基因同时受到miR-29a调控)。对这58个基因进行GO分析,发现4个基因与细胞周期相关(PTP4A1,HMGN3,MAFB,MYCN),6个基因具有转录因子功能(CSDA,EOMES,GAS7,MAFB,NFIA,MYCN),2个基因与凋亡相关(BAK1,MYCN)。在这些基因中,已有报道MYCN、HMGN3、NFIA和PTP4A1可促进细胞增殖,MYCN基因抑制BMSCs凋亡,BAK1基因促进BMSCs凋亡。
结论：
miR-29a可能靶向PTP4A1、HMGN3、NFIA、MYCN基因抑制BMSCs增殖;可能靶向MYCN基因促进BMSCs凋亡,或靶向BAK1基因负反馈抑制BMSCs凋亡。