水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)拮抗细菌的筛选、鉴定及田间防效评价

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水稻纹枯病又称云纹病,是危害水稻的重要病害之一。该病在水稻主产区都有发生,每年可造成经济损失10-30%,严重的可达50%。该病主要是由Rhizoctonia solani引起的真菌病害,具有寄生性、腐生性和寄主范围广泛的特点。该病菌的菌核是水稻重要侵染源,由于菌核对外界的抗逆能力较强,而且存在土壤中,防治起来十分困难。生产上,常用井冈霉素控制该病的发生,但井冈霉素的使用也超过了20多年,田间病菌也存在抗药性的风险,因此,探寻防治水稻纹枯病的新途径刻不容缓。采用生物防治不仅可以减少环境污染和农药残留,而且具有高效、低毒、安全等优势,成为研究的热点。不少研究机构筛选出用于防治水稻纹枯病的拮抗菌,但由于受到外界环境条件的影响,许多拮抗菌的田间效果不稳定,而且容易退化,因此,筛选出新的拮抗菌株十分必要。本研究在前人研究的基础上,拟从稻鸭复合种养田筛选用于防治水稻纹枯病菌的拮抗细菌,并进行菌种鉴定,明确其抑菌活性物质和田间防效,主要研究结果如下:1)水稻纹枯病菌拮抗细菌的筛选采用稀释分离法从稻鸭复合种养田中分离细菌300株,经活性检测结果显示,24株细菌对水稻纹枯病菌具有拮抗作用,占所有筛选菌株的8%。根据菌落形态不同可以分为圆形、不规则、放射状、椭圆形。根据菌落表面光滑程度不同可以分为表面光滑型和表面粗糙型。根据菌落边缘整齐程度不同分为边缘整齐和边缘不整齐型。根据菌落的颜色不同分为淡黄、灰白、乳白、苍白、棕色、淡紫。根据菌落透明程度不同可以分为有光泽和不透明。在24株拮抗细菌中,其中拮抗细菌B137W对水稻纹枯病菌抑制作用最强,抑制率可达72.32%,而且对水稻纹枯病菌的抑制效果稳定,其他拮抗细菌的抑制较弱。因此,本研究选用拮抗细菌B137W作为水稻纹枯病菌拮抗细菌,以备下一步研究。2)水稻纹枯病菌拮抗细菌B137W的鉴定研究结果显示:拮抗细菌B137W对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)的拮抗效果最好,其抑菌带宽度可达20mm,其次为辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea),其抑菌带宽度为10mm,对稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)、草莓炭疽病菌(Colletotrichum fragariae)、草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)、烟草赤星病菌(Alteraria alternata)、烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica)、柑橘青霉病菌(Penicillium italicum)也有抑制效果,其抑菌带宽度为8mm,对辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)无抑制效果,其抑菌带宽度为0mm。拮抗细菌B137W的营养带较宽,可在多种培养基上生长,其中在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上生长(NA)速度最快。该菌株菌落为圆形,白色、表面粗糙,不透明、无光泽,无色素,边缘整齐,突起呈扁平状。该菌株革兰氏染色为阴性,杆状或球杆状,无夹馍、无芽孢、具有鞭毛、菌体圆柱状。该菌体表面光滑,杆状或短杆状,边缘整齐,无缺刻,大小约为1μm。该菌株可使氧化酶阳性、接触酶阳性、明胶液化、淀粉水解、可运动、能在28℃条件下生长、柠檬酸盐阳性、丙二酸盐阳性、醋酸盐阳性,但卵磷脂酶测定呈阴性、纤维素分解阴性、甲基红试验阴性、吲哚试验阴性、产H2S阴性、硝酸盐还原阴性、V-P试验阴性、葡萄糖阴性、麦芽搪阴性、蔗糖阴性、木糖阴性。根据上述生物学特征,初步鉴定菌株B137W为产碱菌属。分子生物学鉴定结果显示,该菌株的16S rDNA的序列长度为1433bp,将该序列与NCBI在线数据库中的序列进行比对,拮抗细菌B137W的16S rDNA序列与粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)的16S rDNA序列同源性较高,达到100%。建立的系统发育树上亦显示拮抗细菌B137W与粪产碱菌在进化地位上最接近。将16S rDNA的分子生物学鉴定结果与形态学和生理生化试验结果相结合,鉴定拮抗细菌B137W为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)。3)拮抗细菌B137W抑菌活性提取物成分分析采用GC-MS对拮抗细菌B137W活性成分进行了分析。根据面积归一法计算了各个组分在总成分中的质量分数。依据每种组分含量超过1%,相似度超过80%计算,共检测到43个化合物,鉴定了其中的36个化合物,占总成分的83.72%。该菌株的抑菌活性成分主要为醛类、酸类、酮类、酯类、烷类、醇类、胺类、肽类、哌嗪、酚类等物质。抑菌酸类物质和烷类物质占的比例最高达到了24.24%,酯类物质占的比例为15.15%,酮类物质占12.12%,哌嗪类和胺类物质占6.06%,其他物质,如:酚类物质、醇类物质、肽类物质所占的比例相同均为3.03%。4)拮抗细菌B137W活性提取物对水稻纹枯病的田间防效拮抗细菌B137W活性提取物对水稻纹枯病菌具有较好的防治效果。拮抗细菌B137W活性提取物的浓度越高防病效果越好,最佳防效可达82.15%,比对照药剂防效高,是其1.16倍。说明该菌株在田间对水稻纹枯病也具有良好的控制效果,因此,今后可考虑将该菌株开发为生物农药的备选菌株。另外,拮抗细菌B137W活性提取物对水稻的正常生长无影响。说明该提取物对水稻的生长安全,可以在生产上推广和应用。
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