过表达青蒿素合成基因提高青蒿素含量的研究

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疟疾每年在全球范围内造成约100万人的死亡,是全球三大传染病之一。青蒿素是从菊科植物青蒿(Artemisia annua L.)地上部分提取的一种含过氧桥结构的倍半萜,是目前治疗疟疾最有效的药物。但是青蒿素在青蒿中的含量较低,仅为0.01%-0.1%(干重),这使得青蒿素的市场供应能力受到了限制。造成了青蒿素的价格高昂,不发达地区患者难以承受。因此,利用基因工程的手段,过量青蒿素合成途径关键酶基因,从而增加青蒿素在青蒿中的含量,对于控制青蒿素的成本,促进青蒿素的更广泛应用有极其重要的现实意义。本论文围绕提高青蒿素的含量,在青蒿中过量表达了青蒿素代谢途径上的重要基因DXR,DBR2,ALDH1和重要基因组合CYP71AV1,CPR和FPS,并研究了DBR2,ALDH1基因表达的亚细胞定位。本研究得到了如下结果:(1)构建了青蒿素合成途径中重要基因DXR,DBR2,ALDH1的植物表达双边界载体和重要基因组合CYP71AV1,CPR和FPS的植物表达载体,并研究了DBR2、ALDH1表达的亚细胞定位;(2)以青蒿叶片为外植体,采用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的方法转化了青蒿,得到转基因青蒿再生植株。用PCR的方法进行检测,得到转DXR的转基因植株14株,转DBR2的转基因植株15株,转ALDH1的转基因植株15株,转CYP71AV1,CPR和FPS的转基因植株8株;(3)采用Southern blot方法确认了转CYP71AV1,CPR和FPS基因的8株再生植株的目的基因插入均为1到4个拷贝;(4)采用Real-time PCR的方法分析了转CYP71AV1,CPR和FPS的转基因植株中目的基因的表达情况。除1株外,其余植株目的基因表达量均被上调;(5)采用HPLC-ELSD方法检测了转DXR的转基因植株、转DBR2的转基因植株、转ALDH1的转基因植株、转CYP71AV1,CPR和FPS的转基因植株的青蒿素含量。结果显示四种转基因植株中青蒿素含量最高分别达到对照的2.8倍、3.4倍、3.8倍、3.6倍。
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