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木质纤维素是全球最为丰富的可再生资源,其生物学酶降解转化为可再生能源,被认为是最具潜力的新能源开发利用领域之一。白蚁是热带、亚热带生态系统木质纤维素的重要分解者,其木质纤维素酶系组成丰富,受到广泛关注。白蚁木质纤维素酶理化特性的研究和相关纤维素酶基因的筛选,对阐明白蚁对木质纤维素的降解机理和拓宽白蚁的利用途径具有重要意义。
本论文以台湾乳白蚁Coptotermes formosanus的木质纤维素酶为研究对象,分析了木质纤维素酶活力测定的理化条件;以华南地区常见的主要白蚁类群为研究对象,比较了不同白蚁间的纤维素酶和半纤维素酶活性大小及肠道分布特点,筛选出具有较高纤维素酶活性的白蚁群体,并进行了白蚁纤维素酶基因的研究。此外,还探究了6种糖基化合物对台湾乳白蚁木质纤维素酶分泌的诱导作用。
主要研究结果如下:
(1)白蚁木质纤维素酶生化特性研究
滤纸酶活(FPA)、内切-β-1,4一葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(BG)、内切-β-1,4-木聚糖酶(EX)及外切-β-1,4-葡聚糖酶(CBH)的最适反应pH值在4.5-5.6之间,最适反应温度为37℃且在温度低于45℃时活力稳定,EG、BG及EX在底物浓度0.001%-2%(w/v)范围内,活性随底物浓度增加而增大,CBH的活性在底物浓度0.001-1 mmol/L的范围内,随底物浓度增加而增大。
(2)华南地区主要白蚁种属的木质纤维素酶活力测定
对广泛采集到的白蚁种群进行高通量酶活性测定,一方面比较台湾乳白蚁室内饲养群体和野外群体的木质纤维素酶活力大小及消化道分布,另一方面比较6个属白蚁群体的相关酶活力大小及消化道分布。结果显示各类酶活性在台湾乳白蚁室内群体和野外群体间无显著差异,但有不同肠道分布比例;各类酶活性水平及分布在特定种属之间有一些共同特性,同时在相同种属间又有一定的差异。
(3)不同糖基化合物对台湾乳白蚁木质纤维素酶分泌的诱导
选用1%木质素、1%羧甲基纤维素钠、1%山梨糖、1%果糖、1%葡萄糖及1%半乳糖6种糖基化合物溶液,诱导台湾乳白蚁木质纤维素酶的分泌,并进行了酶活力测定。结果表明,木质素、果糖及山梨糖对其内源性木质纤维素酶诱导作用明显,而6种化合物对台湾乳白蚁后肠微生物来源的糖基水解酶基本为抑制作用。
(4)台湾乳白蚁和黄胸散白蚁Reticulitermes flaviceps纤维素酶BG、EG新基因的筛选
利用已登入NCBI数据库的BG与EG酶序列信息,采用简并PCR及RACEs
方法得到cDNA3末端6个700-1300bp左右的核苷酸序列:RfBGl(956bp)、RtBG2(737bp)、RfBG3(1291bp)、RfEGl(715bp)、CfEGI(1073bp)和CfEG2(1243bp),BLAST同源比对表明RfBG1、RtBG2和RfBG3是BG酶的部分序列,RfEG1、CfEGI和CfEG2是EG酶的部分序列。