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近年来,有研究表明作为新的干细胞标记物,Lgr5与Wnt/β-catenin共同组成了重要的信号通路,对肿瘤干细胞生物学活性的调控也起着重要的作用。然而,有关该通路与胃癌干细胞方面的研究,却罕有报道。前期的相关研究表明该通路关键蛋白在胃癌细胞中的表达高于普通胃细胞,Lgr5与胃癌的恶性程度及微血管的密度呈正相关。因此,Lgr5-Wnt/β-catenin通路是否参与胃癌干样细胞的活性调控,是否通过调节相关蛋白的表达维持了胃癌干样细胞的恶性生物学行为仍需进一步研究。本实验拟通过RNAi技术阻断该通路,观察干扰后胃癌干样细胞生物学特性以及相关靶基因的表达变化,并利用CCK8、annexinV标记、流式细胞仪等方法综合分析胃癌干样细胞的增殖、凋亡以及血管生成、氧代谢等生物学行为改变情况。借此寻找一个全新的胃癌干细胞研究靶点,为今后开展胃癌生物治疗奠定基础。由于胃癌干细胞缺乏特异性分子标记物,因此,确切地说,各个研究所得到的应是富集胃癌干细胞的干样细胞。目前CD44是普遍接受的胃癌干细胞分子标记物,然而,CD44单独分选出的胃癌悬浮球细胞的干性较差,并不具有明显的优势,因此亟待一个新的分子标记物的出现来提高分选所得细胞的干细胞特性。CD24、CD133、Tff2等分子虽有一定作用,然而却缺乏特异性。近来,CD54被认为是胃癌干细胞的分子标记物,CD44+CD54+的胃癌细胞具有更高的成瘤率和增殖能力。这为提高胃癌干样细胞的富集度提供了条件。在本研究中,我们首先进行胃癌干样细胞提纯研究。随机选取四种人胃癌细胞系(AGS、BGC-823、MKN-28、MKN-45)进行悬浮球细胞培养,稳定传代后使用流式细胞仪分选出分子标记物为CD44+CD54+的实验组悬浮球细胞和CD44+CD54-的对照组悬浮球细胞。并通过悬浮球形成、平板克隆、增殖检测、抗化疗药物及裸鼠成瘤等实验对比实验组细胞和对照组细胞的差异,结果显示CD44+CD54+悬浮球细胞具有更强的干细胞特性,是富集度更高的胃癌干样细胞。接下来,我们就Lgr5在胃癌干样细胞中的功能进行了研究。]RT-PCR结果提示Lgr5在胃癌干样细胞的表达量明显高于普通胃癌细胞。深入研究发现,将Lgr5干扰慢病毒稳定转染入胃癌干样细胞后,其悬浮球形成能力、平板克隆能力、增殖能力、抗化疗药能力及裸鼠成瘤能力,较感染前明显下降。同时检测β-caenin、Ki67、 EphA3和EphrinA5等的mRNA和蛋白的表达,发现其同Lgr5的变化具有一致性。这些都说明Lgr5-Wnt/β-catenin信号通路在维持胃癌干样细胞的生物学特性方面起到了重要作用。