糖尿病性视网膜病变是糖尿病最常见的微血管并发症之一，对视力的危害十分严重，导致大量患者失明，给患者本人、家庭和社会带来沉重的负担，已成为发达国家及发展中国家主要的致盲原因之一。目前尚未寻找到有效的办法预防和治疗，已成为眼科界面临的棘手的医学难题。血糖控制不良及糖尿病病程长是DR发生的主要危险因素，但这并不足以解释DR发生的家族、种族和人种的差异性，遗传因素是DR发病中不可忽视的重要因素之一。有关DR的遗传学研究成为探索其发病机理和新的防治方法的突破点，对易感基因的研究成为DR遗传学研究中的热点。 DR发病与多元醇—肌醇代谢异常、蛋白质的非酶糖基化、自由基作用、脂质代谢、细胞凋亡、免疫炎症反应及细胞因子等多种因素有关，因此，既往易感基因的研究主要围绕上述因素的遗传机制展开。但这些研究未能达到预期的效果。 我们希望通过基因芯片技术筛选出可能抵抗DR发生的基因，通过体内实验验证所选基因对DR的抵抗作用，并探讨其可能的作用机制。为DR的治疗寻找到新的靶点，为DR的发生发展寻找到新的研究途径。本课题从以下3个部分进行： 第一部分糖尿病视网膜病变抵抗基因的筛查 目的： 通过基因芯片技术，寻找“genetic factors in maintaining good health”的健康基因，为DR的治疗寻找到新的靶点，为DR的发生发展寻找到新的研究途径。 方法： 建立严格的入选和排除标准，选择20年或20年以上病程的2型糖尿病患者，以是否发生DR分为眼底正常组(normal组，N组)和PDR组(P组)，每组6人。取静脉血，利用基因芯片技术对比分析两组患者的基因表达，重点关注在N组中特异高表达的基因(P<0.05)。对差异基因进行分析并利用互联网进行差异基因表达谱分析及蛋白功能分析。从中选择1个基因，再重新选择两组病例，标准与前次相同，利用real—time PCR技术验证这个基因的表达。 结果： 基因芯片结果寻找到P<0.05的差异表达基因172个，P<0.01的差异表达基因24个；real—time PCR.进一步验证了核运输因子2(nuclear transport factor2，NTF2)基因在N组显著性高表达。选择NTF2作为下一步研究的对象。 第二部分重组AAV2-NTF2对人视网膜微血管内皮细胞(HRCECs)VEGF的影响 目的： 构建真核表达载体rAAV2-NTF2，将外源性NTF2导入培养的细胞内，观察NTF2表达情况及外源性NTF2对细胞增殖及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的影响，为后续研究工作奠定基础。 方法： 2％胰蛋白酶和0.1％Ⅱ型胶原酶消化视网膜，获得视网膜微血管内皮细胞；接种于预先包被纤维连接蛋白的培养瓶内，用含10％胎牛血清、内皮细胞生长因子、胰岛素—转铁蛋白—硒添加物的内皮细胞培养基，置于5％CO2、37℃培养箱内培养。相差显微镜观察细胞形态及生长情况。抗第Ⅷ因子相关抗原抗体及乙酰化LDL吞噬实验鉴定内皮细胞。免疫组化法观察HRCECs中NTF2的表达、分布。 用基因克隆的方法将NTF2基因片段连接到pSNAV通用型载体，构建重组质粒pSNAV—NTF2，转染BHK—21细胞建立生产细胞系，重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/△UL2进行包装，纯化后得到rAAV2-NTF2。照105v.g./cell的剂量进行rAAV2-NTF2病毒转染，分别设空白和阴性对照，激光共焦显微镜下观察EGFP阳性细胞，RT—PCR检测各组NTF2、VEGF mRNA的表达变化，Gel analyser软件测定各条带IOD值，分别与对应β—actin IOD值相比，进行定量分析。 结果： 1、原代培养的人视网膜微血管内皮细胞48-72h贴壁，2周左右细胞融合。较早代数细胞保持内皮细胞特性，融合前血管内皮细胞呈梭形生长，形态、大小基本一致，第Ⅷ因子相关抗原鉴定及乙酰化LDL吞噬实验阳性。 2、体外培养的HRCECs可表达NTF2，主要位于胞浆内，富集于核周。 3、通过PCR、酶切鉴定，证实重组rAAV2-NTF2构建正确。 4、rAAV2-EGFP转染后48h，激光共聚焦扫描显微镜观察可见大量EGFP阳性细胞，实验组NTF2在mRNA水平表达明显强于阴性对照组和空白对照组，同时VEGF表达明显下降。 第三部分重组AAV2-NTF2对糖尿病大鼠血视网膜屏障和视网膜血管内皮生长因子表达的影响 目的： 观察NTF2在糖尿病视网膜病变过程中的时空表达，及其对糖尿病视网膜病变的保护作用。 方法： 1.视网膜NTF2表达时空动态变化 成年雄性Wistar大鼠60只，STZ腹腔注射诱导糖尿病，分别提取成模后2周、1、3、6个月大鼠及正常大鼠视网膜总RNA，通过逆转录—聚合酶链式反应(RT—PCR)检测NTF2、VEGF mRNA的表达变化。Gel analyser软件测定各条带IOD值，分别与对应β—actin IOD值相比，进行定量分析。分别取糖尿病组和正常组大鼠眼球固定、石蜡包埋、切片后，应用免疫荧光组织化学技术检测NTF2的表达，荧光显微镜观察。 2.血—视网膜屏障功能的形态学观察： 分别取成模后2周、1个月大鼠及正常大鼠以45mg/kg的剂量行伊凡思蓝(EB)静脉注射，2小时后摘出眼球，固定后取视网膜制备全视网膜平铺片，用激发光为546nm波长的滤光片在荧光显微镜下观察染料的位置并摄片。 3.观察rAAV2-NTF2抵抗糖尿病大鼠血视网膜屏障功能损伤作用 成年雄性Wistar大鼠36只，以左眼为实验眼，右眼为对照眼，微量注射器分别玻璃体腔注射rAAV2-NTF2和rAAV2-EGFP4ul。1个月后取4只大鼠右眼，固定后取视网膜制备全视网膜铺片，荧光显微镜下观察EGFP表达情况。再行STZ腹腔注射诱导糖尿病，同时设单纯糖尿病组(Diabetic，D组)和空白对照组(Normal，N组)。成模1个月后以45mg/kg的剂量静脉注射EB，循环2h后1％多聚甲醛枸橼酸缓冲液灌注并摘除眼球取视网膜，置于甲酰胺中浸泡提取染料，用分光光度计测量甲酰胺中染料的浓度。 提取单纯糖尿病组(D组)，单纯眼内注射组(NTF2，EGFP组)，实验组(D+NTF2组，D+EGFP组)以及正常对照组(N组)大鼠视网膜总RNA，通过逆转录—聚合酶链式反应(RT—PCR)检测NTF2、VEGF mRNA的表达变化。Gelanalyser软件测定各条带IOD值，分别与对应β—actin IOD值相比，进行定量分析。 结果： 1.视网膜NTF2表达时空动态变化 与糖尿病大鼠年龄匹配的正常大鼠视网膜NTF2和VEGF并未随时间延长而变化，mRNA表达稳定。糖尿病成模2w后开始，NTF2 mRNA有轻度增高，并随病程的延长保持较高水平，病程达6个月时，NTF2表达开始回落，而VEGF则表现为随病发展表达逐渐升高，3个月时轻度下降，但6个月时又明显升高。NTF2与VEGF在糖尿病病程中变化趋势不同。NTF2主要位于视网膜节细胞层以及内核层，正常鼠和糖尿病大鼠视网膜NTF2免疫组化检测无明显差异。 2.血—视网膜屏障功能形态学改变 EB注射后，视网膜平铺片在荧光显微镜下可清晰地观察到视网膜各级血管的形态。正常状态下视网膜血管管壁清晰，染料在血管内没有外漏。糖尿病2周大鼠视网膜背景荧光增强，可见周边部渗漏点；糖尿病1个月后视网膜血管内的荧光染料渗漏增加，以视网膜微静脉和毛细血管的渗漏增强为主。 3.rAAV2-NTF2抵抗糖尿病大鼠血视网膜屏障功能损伤作用 糖尿病2周和1个月大鼠视网膜内伊凡思蓝浓度增高，后者是正常组的3.74倍P<0.001，提示血—视网膜屏障(BRB)受损。玻璃体腔注射rAAV2-NTF2可以部分改善BRB的破坏，降低伊凡思蓝—白蛋白渗漏，P<0.05。 实验眼(D+NTF2组)NTF2mRNA水平明显高于对照眼(D+EGFP组)，提示rAAV2-NTF2转染成功，同时其VEGF mRNA水平明显低于对照眼，NTF2能抑制VEGF表达。 结论： 1.通过基因芯片技术检测糖尿病患者差异基因表达情况，发现NTF2在眼底正常组表达水平显著高于并发DR组，推测该基因可能具有保护视网膜血管、抵抗DR的发生的作用，并首次提出DR抵抗基因概念。 2.成功构建了重组rAAV2-NTF2，并可有效转染人视网膜微血管内皮细胞。 3.rAAV2-NTF2转染视网膜内皮细胞后，NTF2可稳定高表达，进一步检测发现VEGF表达下降，推测NTF2可能通过调节VEGF表达参与新生血管发生。 4.首次发现NTF2主要表达在视网膜节细胞和内核层，推测其与神经及血管组织关系密切；随糖尿病病程进展，NTF2和VEGF在糖尿病大鼠模型视网膜组织表达呈负相关，提示NTF可能是参与DR的重要因子。 5.首次研究证实rAAV2-NTF2可成功转染大鼠视网膜组织并稳定高表达，发现NTF2表达增强可显著减轻糖尿病大鼠视网膜血视网膜屏障功能的破坏，该作用可能通过抑制VEGF实现。