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菜用大豆(Glycinemax(L.)Merr.)属于豆科,又称毛豆,是一种重要的豆类蔬菜。在其生长发育过程中常受到多种病虫害的危害,大豆花叶病毒(Soybean mosaic vi rus,SMV)病是众多病害中分布最广、对产量和品质影响最大的病害之一,它的危害区域广,破坏性强,严重影响大豆的产量和品质。SMV属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus),寄主范围狭窄,主要局限于豆科植物。Potyvirus是世界上最大的、对大豆生长影响最重要的植物病毒属。Potyvirus病毒编码11个蛋白,通过与其它编码蛋白及寄主蛋白的相互作用来共同完成病毒的侵染循环。其中P3蛋白既是Potyvirues三个膜蛋白之一,又是Potyvirues多聚蛋白中变异性最大的,因此研究P3蛋白与其寄主的互作关系更有利于我们研究膜相关蛋白在病毒复制中的功能及机理,从而进一步分析Potyvirues的复制机制以及为病害防治提供理论指导。本实验室前期利用SMV6067-1分离物的P3序列构建诱饵载体,通过酵母双杂交(Y2H)的方法初步筛选菜用大豆品种’南农1138-2’的cDNA文库,筛选与大豆花叶病毒P3蛋白互作的寄主蛋白36个。本研究从中选取了 2个寄主蛋白endo-1,3-beta-glucanase 和 cysteine proteinase inhibitor,分别命名为 GmGLu 和 GmCYS,从大豆感病品种’南农1138-2’中分别克隆出这两个基因的编码区全长,利用酵母双杂交、双分子荧光互补和qRT-PCR技术对这两个基因的功能进行了鉴定。主要研究结果如下:(1)采用膜蛋白酵母双杂交系统,将2个菜用大豆蛋白(GmGLu、GmCYS)编码区全长构建到酵母表达载体pPR3-N中,与pBT3-STE-P3共转化结果表明,SMV P3可分别与2个候选菜用豆蛋白在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal培养基上生长良好,且呈蓝色阳性菌落。该结果初步表明,SMVP3可与这2个候选菜用大豆蛋白互作。(2)进一步通过双分子荧光互补(BiFC)试验对以上互作进行体内验证。将SMV-P3与2个菜用豆蛋白(GmGLu、GmCYS)分别构建到BiFC载体pEarleyGate201-YC和pEarleyGate202-YN,融合表达载体通过农杆菌介导在本氏烟叶片内进行瞬时表达。接种农杆菌的叶片采用激光共聚焦显微镜进行荧光观察。结果表明,SMVP3与2个大豆蛋白均可以发生强烈互作,产生稳定的荧光。其中,P3与大豆GmGLu的互作出现在本氏烟细胞的细胞膜,与大豆GmCYS的互作区域在细胞膜和细胞核上。蛋白亚细胞定位结果与BiFC结果类似,GmGLu蛋白定位在细胞膜,GmCYS蛋白定位在细胞膜和细胞核,SMV P3与2个候选菜用大豆蛋白具有互作关系。(3)采用实时荧光定量RT-PCR,对SMV胁迫下2个菜用大豆基因的表达量进行了动态表达分析。结果表明,在SMV侵染下,两8个菜用大豆基因在24hpi、48hpi、72hpi、14dpi均呈表达量上调,GmGLu在处理24h后表达量有所增加,在处理72h表达量达到最高,之后表达量随时间推移有所下降,而且在72h时产生显著性差异。GmCYS在24 h时表达量最高,之后表达量开始降低,在24h和14d时差异性显著。SMVP3可与2个菜用大豆蛋白(GmGLu、GmCYS)直接互作,进而参与了 SMV的侵染。