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木薯(Manihot esculenta Crantz)是热带亚热带地区重要的块根淀粉作物,也是中国热区重要的经济作物。木薯喜温热、不耐霜,低温是木薯生长发育及地理种植受限的重要因素,利用转基因技术有针对性的改良木薯耐寒性、提高木薯抗寒能力具有重大意义。膜联蛋白(Annexins,Ann)是一类Ca2+及磷脂结合蛋白,广泛存在于动植物的各种组织细胞中。植物膜联蛋白在植物生长发育及逆境胁迫应答过程中起重要作用。本研究采用RT-PCR技术,从木薯中分离了 10个木薯膜联蛋白基因MeAnnl-10,通过对这些基因及其启动子生物信息学分析以及基因表达分析,初步探讨了木薯MeAnns基因在非生物胁迫中的功能,同时发现在4℃低温胁迫下MeAnnl0的相对表达量可以快速提高,进一步对MeAnnl0基因的亚细胞定位及拟南芥中的表达进行了研究,初步分析MeAnn10基因的功能以及对低温的响应。主要研究结果如下:1、采用RT-PCR技术,从木薯(SC8)中分离克隆了 10个木薯膜联蛋白基因MeAnn1-10。登录号分别为:MeAnn1(KM975562)、MeAnn2(KM975563)、MeAnn3(KM975564)、MeAnn4(KM975569)、MeAnn5(KM975565)、MeAnn6(KM975566)、MeAnn7(KM975567)、MeAnn8(KM975567)、MeAnn9(KP171695)、Me Ann 10(KP171696)。2、进化分析表明,木薯MeAnns蛋白与拟南芥膜联蛋白、蓖麻膜联蛋白及杨树膜联蛋白亲缘关系较近。3、染色体定位分析显示,10个MeAnns基因分布在木薯6条染色体上;结构分析显示,10个MeAnns基因具有4-6个外显子,但长度彼此不同。4、保守结构域分析显示,MeAnns基因编码的蛋白具有4个典型的annexin重复结构域(Domain Ⅰ-Ⅳ)(MeAnn5、MeAnn6 无 Domain Ⅰ);在 Domain Ⅰ 和 DomainⅣ中含有典型的Ⅱ型Ca2+结合位点(K/GXGT-38-D/E);此外Domain Ⅰ中还含有一个磷脂和血红素结合位点,Domain Ⅲ中的F-actin结合基序(IRI),Domain Ⅳ中含GTP结合位点(DXXG)。5、蛋白结构分析显示,MeAnns蛋白与AtAnn1蛋白的3D结构类似,均含由5个 α-helix(A-B)组成的膜联蛋白 Domain,其中 A、B α-helix loop 区与 D、E α-helix loop区相互靠近组成一个保守的Ca2+结合位点;此外,每一个MeAnn蛋白还含有其他与Ca2+结合有关的“XGD”motif。综上所述,我们分离克隆的10个木薯MeAnns属于植物膜联蛋白家族的成员。6、启动子分析显示,MeAnns启动子区域具有多种胁迫响应元件,如:LTR、HSE、MBS、TC-rich repeats、ABRE、ERE、TCA-element、TGA-element 及 GARE-motif等,推测木薯MeAnns可能参与非生物胁迫应答、激素信号应答及光合作用的调控。7、基因表达分析显示:1)MeAnns基因的表达具有组织特异性,其中MeAnn4、MeAnn9分别在根和叶中优势表达;2)MeAnns基因表达受外源Ca2+浓度调节,MeAnn10基因的表达受Ca2+浓度诱导明显上调,其峰值为起始值的157倍,MeAnn5对Ca2+诱导十分敏感;3)木薯MeAnns基因能够通过不同方式响应盐、干旱、低温、高温及氧化胁迫,300 mmol/LNaCl处理后MeAnn10基因表达显著提高(16倍);MeAnn7受干旱及高温诱导,同时对氧化胁迫很敏感;MeAnn6、MeAnn7和MeAnn10能积极响应低温胁迫,低温胁迫后其峰值分别为起始值的23.8、101.2、24.4倍;4)MeAnns基因表达受外源植物激素调控,其中MeAnn1、MeAnn4、MeAnn5及MeAnn10基因在外源ABA、GA、IAA、SA及JA处理下,相对表达值均上调。8、木薯MeAnn10能快速响应低温胁迫,在4℃低温胁迫3 h时,显著提高11.7倍,在12h达到峰值并一直保持较高水平的表达。推测其在低温应答中起重要作用,因而对MeAnn10进行深入研究。构建融合表达载体p1300-MeAnn10:GFP并转化木薯,获得稳定表达的MeAnn1O:GFP蛋白的愈伤组织,细胞定位结果显示MeAnn10:GFP基因主要定位于细胞质和细胞核中。9、将MeAnn10构建植物过表达载体pVKH-35S-MeAnn10并转化拟南芥,获得过量表达转基因植株。表型分析显示:低温处理后Col-0型拟南芥叶片受损、白化死亡,而转基因植株却长出新叶,说明转MeAnn10基因的拟南芥耐寒能力更强。在正常生长条件下,MeAnn10转基因和Col-0型拟南芥中的叶绿素、电导率、SOD、MDA、可溶性糖及脯氨酸的含量差异不显著,而低温胁迫后转基因拟南芥的叶绿素、SOD、可溶性糖及脯氨酸含量均显著高于野生型;相对电导率及MDA含量明显低于Col-0型拟南芥;说明MeAnn10转基因拟南芥低温抗寒性比Col-0型。qRT-PCR分析发现,低温胁迫3 d后,拟南芥中MeAnn10基因显著上调。上述结果进一步验证MeAnn10基因能响应低温胁迫。