川丁特罗,2-(3-氯-4-氨基-5-(三氟甲基)苯基)-2-(叔丁氨基)-乙醇,是沈阳药科大学药化实验室自主合成的一种结构全新的β2-肾上腺素受体激动剂。川丁特罗具有选择性高、低毒、长效等特点,在中国正处于Ⅲ期临床研究阶段。本论文的研究目的是结合多种方法制备川丁特罗代谢物对照品,并对其进行结构鉴定,系统研究川丁特罗在大鼠体内、微生物模型及大鼠和人体外肝微粒体孵育体系中的代谢情况,并利用获得的代谢物对照品,研究川丁特罗及其主要代谢物在大鼠体内的排泄情况,以及对川丁特罗的主要代谢物进行酶表型确认研究。为全面评价川丁特罗的有效性和安全性提供依据并为临床安全、合理用药提供指导。一、川丁特罗代谢物对照品的制备及结构鉴定建立了短刺小克银汉霉AS 3.970的微生物模型,并进行了转化条件优化,用于川丁特罗在微生物体内的代谢研究及代谢产物的制备。通过对川丁特罗的短刺小克银汉霉AS 3.970制备规模的转化液样品和大鼠多剂量灌胃给予川丁特罗后收集的尿液样品中的代谢物的分离纯化,获得了5种代谢物对照品;设计并优化了川丁特罗羟胺衍生物的合成方法,通过同生物体内代谢物色谱和质谱行为的比较,确认其为川丁特罗体内代谢物之一。综合运用核磁共振光谱(NMR)、电喷雾离子化质谱(ESI-MS/MS)和飞行时间高分辨质谱(TOF-MS)对制备得到的6种代谢物对照品进行结构鉴定,确定其分别为:2-(3-氯-4-(羟基氨基)-5-(三氟甲基)苯基)-2-(叔丁氨基)-乙醇(即川丁特罗芳香羟胺代谢物,M2)、2-(3-氯-4-氨基-5-(三氟甲基)苯基)-2-(2-羟基-1,1-二甲基)乙氨基-乙醇(即川丁特罗叔丁基羟基取代代谢物,M3)、2-(3-氯-4-氨基-5-(三氟甲基)苯基)-2-(叔丁氨基)-乙酸(即1-羧基川丁特罗,M4)、2-(3-甲基亚磺酰基-4-氨基-5-(三氟甲基)苯基)-2-(叔丁氨基)-乙醇(即川丁特罗甲基亚砜取代代谢物,包含一对差向异构体,M5和M6)和2-(3-甲磺酰基-4-氨基-5-(三氟甲基)苯基)-2-(叔丁氨基)-乙醇(即川丁特罗甲基砜取代代谢物,M7)。除M4外,其余均为首次制备得到的代谢物对照品。其中,川丁特罗芳香羟胺代谢物(M2)具有不稳定的性质,容易发生氧化还原反应,本实验初步考察了其稳定性并进行了探讨,发现其在酸性条件下最为稳定。实验中获得的代谢物对照品可用于川丁特罗代谢物结构鉴定、体内排泄及酶表型确认研究。二、川丁特罗大鼠体内及微生物模型中的代谢研究采用HPLC-MS/MS分析方法,综合分析代谢产物的准分子离子和多级碎片离子,并与6种代谢产物对照品比较,结合药物体内代谢规律,系统研究川丁特罗在大鼠体内和微生物模型中的代谢情况,鉴定了代谢物结构。共检测到20种代谢物,包括4种Ⅰ相代谢物:苯环单羟基取代代谢物(M1)、芳香羟胺代谢物(M2)、叔丁基单羟基取代代谢物(M3)和1-羧基川丁特罗(M4);16种Ⅱ相代谢物:川丁特罗N-或O-葡萄糖醛酸结合物(M8和M9)、单羟基取代川丁特罗的葡萄糖醛酸结合物(M10、M11和M12)、乙酰化代谢物(M13)、川丁特罗N-或O-葡萄糖结合物(M18、M19)、硫酸结合物(M20)、川丁特罗脱氯后的谷胱甘肽结合物(M14)及其进一步发生分解、氧化代谢生成的次级代谢产物,即半胱氨酰甘氨酸结合物(M15)、半胱氨酸结合物(M16)、乙酰半胱氨酸结合物(M17)、甲基亚砜取代代谢物(M5和M6)和甲基砜取代代谢物(M7),其中13种为首次检测到的代谢物。观察到大鼠体内代谢途径主要单羟基化、C-氧化、乙酰化、葡萄糖醛酸化,这些代谢途径还可能相互交叉,生成次级代谢产物。此外,还发现了一种新的重要的代谢途径,即谷胱甘肽结合及其进一步发生分解代谢、氧化代谢途径。在微生物模型中发现5种代谢途径,除了同体内代谢途径相同的单羟基化、C-氧化及乙酰化外,还首次发现了葡萄糖结合和硫酸结合代谢途径,微生物模型中未发现这些代谢途径的相互交叉及生成的次级代谢产物。川丁特罗在大鼠体内和微生物模型中的代谢差异主要体现在Ⅱ相代谢物的种类。此结果说明微生物转化可以作为研究药物体内代谢的一个重要工具,但是其只能部分替代实验动物,而不可能将其完全取代。三、川丁特罗及其主要代谢物在大鼠体内排泄研究为了深入了解川丁特罗及其主要代谢物大鼠体内排泄情况,建立了同时测定大鼠尿液和粪便样品中川丁特罗及及代谢物M2、M3、M4和M7浓度的HPLC-MS/MS方法,该法专属、快速、灵敏、准确,成功应用于川丁特罗灌胃给予大鼠后的排泄实验研究。同时通过对经葡萄糖苷酸酶水解后尿液样品的分析,计算得到川丁特罗及代谢物M2、M3的葡萄糖醛酸结合物的累计排泄量占给药剂量的百分比。大鼠灌胃给予川丁特罗后,原形药、M2、M3、M4、M7、原型的葡萄糖醛酸结合物及M2和M3的葡萄糖醛酸结合物物的累积排泄总量约为给药剂量的28%。针对上述几种形式而言,尿液是最主要的排泄途径,其次是粪便,二者的比值约为7.6:1。代谢物M4是川丁特罗最主要的排泄形式,其次是原型和M2,它们的累积排泄量分别约占剂量的12.72%、4.40%和4.36%。原型药从粪便排泄的比例略高于尿液,M3和M4主要从尿液排泄,其它几种代谢物(M2、M7和葡萄糖醛酸结合物)则仅从尿液排泄。四、川丁特罗体外代谢物鉴定及代谢物M2和M3的CYP450酶表型确认研究采用同体内代谢物鉴定相同的分析方法,以NADPH作为辅因子,研究了川丁特罗在大鼠肝微粒体和人肝微粒体中的代谢情况,结果显示,二者产生的代谢产物相同,包括两种单羟基化代谢物(M2和M3)、一种C-氧化代谢物M4以及一种Ⅱ相的乙酰化代谢物(M13),提示川丁特罗在大鼠和人体的Ⅰ相代谢不存在明显的种属差异,且CYP450酶对川丁特罗的代谢消除起着十分重要的作用。从质谱响应来看,M2和M3是川丁特罗最主要的体外CYP450酶系统代谢产物。建立了同时测定人肝微粒体和重组酶中代谢物M2和M3的UPLC-MS/MS方法,用于进行川丁特罗两个主要代谢物的酶表型确认研究,并进行了方法学验证。结合化学抑制剂法和重组酶法,考察了六种重组酶 CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4 和 CYP2E1,并最终确定CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4可催化川丁特罗生成芳香羟胺代谢物M2,且CYP2C19具有最大的亲和力和最高反应速度及最大的内在清除率;CYP2C19和CYP3A4均可催化川丁特罗生成代谢物M3,针对这一代谢途径,CYP2C19对底物的亲和力更大,但是CYP3A4具有更大的最大反应速率和内在清除率。实验研究结果提示当川丁特罗同CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的抑制剂或诱导剂共同服用时,可能会引起川丁特罗或代谢物血药浓度的变化,从而产生一定安全性问题。