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目的：优化设计LfcinB基因，构建pGEX-4T-1-LfcinB重组分子；利用PCR技术对LfcinB基因进行定点突变，构建pGEX-4T-1-m3’14LfcinB表达重组体；将两种重组体分别在大肠杆菌BL21中融合表达，测定抗菌活性。
方法：根据Genebank中LfcinB DNA序列及氨基酸残基序列，按照Codon Usage Database中大肠杆菌偏爱的密码子原则对LfcinB基因进行优化设计。利用基因重组技术构建克隆重组体pUC-18-LfcinB，转化至大肠杆菌DH5α中，进行酶切、PCR及测序鉴定；构建表达重组体pGEX-4T-1-LfcinB，转化至大肠杆菌BL21中，进行酶切、PCR及测序鉴定。利用反转PCR法定点突变技术，采用TaKaRa MutanBEST kit对重组体pGEX-4T-1-LfcinB中LfcinB第3位Cys密码子TGC、14位Gly密码子GGT实施定点突变，均突变为Try密码子TGG。将突变体转化至大肠杆菌BL21中，挑取阳性菌落进行酶切、PCR及测序鉴定。将两种阳性的重组表达转化菌用IPTG 37℃诱导表达，全菌体蛋白SDS-PAGE观察表达结果。用B-PER GSTSpin纯化试剂盒纯化融合蛋白，SDS-PAGE观察得到的融合蛋白是否以包涵体形式存在。用凝血酶切割融合蛋白，GST Spin柱纯化，抑菌圈实验初步鉴定LfcinB和m3’14’LfcinB的抗菌活性。
结果：
1．获得优化的LfcinB DNA片段，大小为94bp；构建了克隆重组体PUC-18-LfcinB，经酶切、PCR鉴定和测序，结果表明与预先设计的DNA序列完全一致。
2．构建了表达重组体pGEX-4T-1-LfcinB，并转化至大肠杆菌BL21中，经酶切、PCR鉴定和测序结果表明LfcinB基因与表达载体连接方向正确，可以进行诱导表达。
3．成功实现了对LfcinB基因的定点突变，获得突变型表达重组体pGEX-4T-1-m3’14’LfcinB，并转化至大肠杆菌BL21中，测序结果表明LfcinB DNA序列中第3位Cys密码子TGC、第14位Gly密码子GGT均突变为Try密码子TGG，达到预期突变结果。m3’14’LfcinB基因与融合表达载体连接方向正确，可以进行诱导表达。
4．两种表达菌经IPTG诱导表达3～5小时后，SDS-PAGE电泳结果可见29KD的融合蛋白条带。表达的融合蛋白经B-PER GSTSpin纯化试剂盒纯化后电泳，表明融合蛋白以包涵体形式存在。
5．经凝血酶切割分离融合蛋白GST-LfcinB蛋白和GST-m3’14’LfcinB，获得了LfcinB和m3’14’LfcinB。纯化后的两种蛋白用抑菌圈实验测定抗菌活性，表现出对金黄色葡萄球菌ATCC25938和大肠杆菌的抗菌作用，而且m3’14’LfcinB抑菌圈直径大于LfcinB。
结论：成功构建了表达重组体pGEX-4T-1-LfcinB及突变型表达重组体pGEX-4T-1-m3’14’LfcinB；成功实现了在大肠杆菌中的诱导表达；分离纯化后的LfeinB和m3’14’LfcinB用抑菌圈实验表明具有抗菌活性，为其进一步抗菌活性的定量研究、筛选高活性的LfcinB衍生肽及真核表达奠定了基础。