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本研究中以蟑螂的三个主要变应原Blag2、Peral和Pera7基因为研究对象,通过RT-PCR方法分别扩增目的基因片段,克隆入T-载体,经测序表明它们与NCBI上公布的序列的同源性分别为100%、95.9%及99.6%;经NdeI和NotI双酶切后,目的基因分别亚克隆入表达载体pET24a(+)中,然后分别转化高效表达菌BL21Star;以0.1mM的IPTG进行诱导表达,获得了分子量分别36kD、45kD和33kD的目的蛋白,主要以包涵体形式存在;目的蛋白用包涵体溶解液溶解后,采用Ni2+亲和层析的方法进行纯化,并用透析或稀释复性法对纯化的蛋白进行复性处理;以蟑螂过敏性患者的阳性混合血清为一抗,生物素标记的鼠抗人IgE为二抗,进行Western-blot印迹检测,结果显示三种变应原都具有较好的IgE结合活性。
此外,本研究还把Blag2基因插入pGAP酵母载体,经BspHI线性化后,电转化酵母GS115株。挑取重组子经YPD培养液摇瓶培养3天后,获得了45kD的表达产物,Western-blot证明其具有过敏原性。为进一步研究原核与真核表达产物的差别打下了基础。
本研究克隆表达并纯化了美洲大蠊的主要变应原Peral、Pera7和德国小蠊的主要变应原Blag2,为利用蟑螂主要变应原混合物替代其天然提取液诊断和治疗变态反应性疾病奠定了基础。