论文部分内容阅读
NEDD8是一种泛素样蛋白（Ubiquitin-like protein,UBL）,它介导Neddylation类泛素化修饰过程。同泛素一样,NEDD8在细胞凋亡、DNA损伤、信号转导等过程中发挥重要的作用。NEDD8必须要被NEDD8激活酶（NAE）催化才能产生活性。MLN4924是一种靶向NAE的小分子抑制剂,多项Ⅰ/Ⅱ期临床研究表明,MLN4924能够有效的促进人类肿瘤细胞的凋亡。但MLN4924是一种疏水性药物,水溶性差,生物利用度低;同时,MLN4924缺乏肿瘤靶向能力,容易造成严重的毒副反应。这些问题均阻碍了MLN4924的临床应用。基于这些问题,策略性的设计一种能够主动靶向肿瘤部位且能响应性释放药物的纳米递送系统,有助于实现小分子抑制剂MLN4924的精准递送及减毒增效。本课题拟构建一种基于血小板膜涂层的聚酰胺-胺树枝状大分子（PAMAM）的纳米递送平台（P-PAM/MLN）,使MLN4924能够在体外主动靶向肿瘤细胞和p H响应性的释放,从而提高药物的体外抗肿瘤活性。血小板膜涂层的仿生外壳是一种靶向肿瘤细胞的天然手段;核心的PAMAM具有内部空腔,能够通过疏水作用装载药物,同时纳米粒P-PAM/MLN内化进入肿瘤细胞后,具有p H敏感性的PAMAM通过质子海绵效应破坏溶酶体,促使装载的MLN4924释放,从而诱导肿瘤细胞凋亡。具体如下:1、P-PAM/MLN的制备及表征。采用薄膜分散法合成PAM/MLN纳米粒;从血小板中提取血小板膜,利用超声法制备血小板膜囊泡（PMV）;使用PMV涂覆PAM/MLN制得P-PAM/MLN。通过透射电镜（TEM）、动态光散射（DLS）及激光共聚焦显微镜（CLSM）等手段证明成功制备了PAM/MLN和P-PAM/MLN,它们的粒径分别为15 nm和160 nm。PAM/MLN经过血小板膜伪装后,电位由30 m V降低至-19 m V。P-PAM/MLN的形貌呈球型,具有明显的壳核形态,最佳载药量约为4.77%。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白免疫印迹（Western Blot）的结果确认了P-PAM/MLN携带血小板膜蛋白。不同p H条件下的TEM、DLS和药物释放实验结果表明,P-PAM/MLN具有p H响应性释放药物的能力。在p H 7.4条件下,纳米粒具有稳定的球形结构,MLN4924的释放率仅为15.7%;p H降到5.0模拟细胞内溶酶体的环境,观察到P-PAM/MLN的外壳变形破裂,DLS测得的粒径大于1000 nm,MLN4924被大量释放,48 h的累积释药率达67.3%。体外模拟实验为MLN4924进一步在肿瘤细胞内的释放奠定了基础。2、MLN4924的体外抗肿瘤活性研究。本课题以人类乳腺癌细胞MCF-7为模型细胞,评估游离药物MLN4924的抗肿瘤活性。利用CCK-8细胞活力测定法检测MCF-7细胞经MLN4924处理不同时间后的存活率。MLN4924作用48 h和72 h后,细胞存活率显著降低,存在剂量依赖性和时间依赖性,IC50值分别为0.92μM和0.09μM。MLN4924也能抑制细胞的克隆形成,显著降低了细胞集落的数量。Western Blot实验结果表明,MLN4924能够抑制MCF-7细胞的Neddylation类泛素化修饰,下调NEDD8-cullins蛋白的表达;细胞DNA损伤标志物γ-H2AX蛋白的表达显著升高;凋亡蛋白标志物cleaved caspase-3的表达量同样升高。3、P-PAM/MLN的体外抗肿瘤活性研究。使用阿霉素（DOX）作为荧光信号,可视化P-PAM/MLN的细胞靶向和p H敏感性释放行为。细胞摄取实验结果表明,P-PAM/MLN能够被MCF-7细胞有效的摄取,且摄取行为具有时间依赖性。与裸露的PAM/MLN纳米粒相比,膜涂层后的纳米粒显著减弱了RAW264.7巨噬细胞对它的摄取,具有免疫逃逸能力。肿瘤靶向实验可知,与无肿瘤靶向能力的红细胞膜涂覆的纳米粒R-PAM/MLN相比,血小板涂层后MCF-7细胞对P-PAM/MLN的摄取显著增强。通过CLSM考察制剂在MCF-7细胞内的生物分布,孵育时间为2 h时P-PAM/MLN能够被MCF-7细胞快速摄取,大部分被溶酶体捕获。当孵育时间为4 h时,与溶酶体仍有较高的共定位率,说明进入溶酶体的P-PAM/MLN增加。但是,当孵育时间延长至6 h时溶酶体破裂,共定位率急剧下降,表明PAMAM的质子海绵效应能够促进P-PAM/MLN的溶酶体逃逸及药物的释放。CCK-8法考察了空白载体P-PAM的细胞毒性,载体与细胞共同孵育72 h后,细胞活力仍大于80%,证明载体P-PAM具有良好的体外安全性。进一步考察P-PAM/MLN的细胞抑制能力,P-PAM/MLN孵育72 h后细胞存活率在31%左右,与MLN4924和R-PAM/MLN相比,对MCF-7细胞的抑制作用更加显著,证明血小板膜的包封可以有效促进肿瘤细胞的摄取,从而具有更好的体外抗肿瘤活性。总之,本课题构建的仿生型纳米药物递送系统,提供了一种实现小分子抑制剂MLN4924有效装载和体外靶向递送和p H响应性释放的手段,从而达到减毒增效的肿瘤治疗目的,未来可用于扩展MLN4924的纳米递送系统在体内的应用。