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黄原胶是一种由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)分泌的水溶性多糖,对黄原胶分子结构进行改造,有望为生物医药及食品工业等领域提供新型材料,有着很高的应用价值和发展前景。目前,黄原胶生物降解途径尚未得到完全阐明,阻碍了我们对其进行理性改造的进程。Microbacterium sp.XT11能够利用黄原胶为唯一碳源进行生长,是一株能够有效降解黄原胶的微细菌。前期的基因组数据分析结果表明,XT11的基因组中存在与黄原胶生物降解密切相关的基因簇,阐明该基因簇的结构及表达调控特性,有利于解析黄原胶生物降解的分子机理。因此,本课题以Microbacterium sp.XT11为出发菌株,利用转化辅助重组技术(transformation-associated recombination,TAR),从XT11菌株的基因组DNA中成功钓取黄原胶降解基因簇(Cluster)。该基因簇大小约为17kb,包含有黄原胶内切酶编码基因、葡萄糖苷酶编码基因、甘露糖苷酶编码基因、黄原胶裂解酶编码基因及一个转录调控元件和一个ABC型糖转运系统编码基因。本工作利用酿酒酵母高效的同源重组机制、并借助GFP报告基因优化筛选效率,成功地将该基因簇连接到枯草-大肠穿梭表达质粒pAX01,获得携带黄原胶降解基因簇的重组表达质粒pALHC。重组表达质粒pALHC的构建为后续的基因簇异源表达及结构解析研究打下了基础。随后,本工作利用反转录技术和荧光定量PCR技术考察了黄原胶降解基因簇内各基因元件转录及表达情况。结果表明,黄原胶内切酶编码基因作为一个独立的转录单元进行表达调控,而其他四个蛋白编码基因(ABC型糖转运系统编码基因、葡萄糖苷酶编码基因、甘露糖苷酶编码基因、黄原胶裂解酶编码基因)共属一个转录单元。该结果说明黄原胶降解基因簇可能受到多种反式作用因子的调控。基因表达水平研究结果表明,相比以葡萄糖为碳源生长,XT11在以黄原胶为唯一碳源生长时,黄原胶降解基因簇内各基因的表达水平均上升,然而在后一个转录单元中,甘露糖苷酶编码基因前可能存在一个内源性的启动子,导致其表达量上升。最后,基于降解基因簇内基因转录及表达结果,分别利用启动子预测网站Softberry和MEME suite对基因簇内可能的启动子序列和调节基序进行预测。结果显示,分别在黄原胶内切酶编码基因上游、ABC型糖转运系统编码基因上游和甘露糖苷酶编码基因上游预测出三个启动子,其共有的调节基序为TCNATNCT。通过电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)尝试钓取参与基因簇各元件表达调控的反式作用因子。回收结合蛋白并利用液质联用仪分析得到6种可能的调控蛋白,分别为单链DNA结合蛋白(LX1-1GL000807)、假定蛋白,转录调节因子K(LX1-1GL000216)、RpiR家族转录调节因子(LX1-1GL000455)、冷激蛋白,DNA结合蛋白(LX1-1GL001153)、假定蛋白,DNA介导的RNA聚合酶,σ亚基(LX1-1GL000256)、冷激蛋白,DNA结合蛋白(LX1-1GL000925)。本课题的研究成果为后续黄原胶降解途径解析和黄原胶分子理性改造打下基础。