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实体肿瘤中存在乏氧微环境，肿瘤细胞经乏氧应激反应而调控其下游基因，从而使肿瘤细胞对乏氧微环境产生适应性调节反应。在这种适应性过程中，HIF-1起到枢纽作用，即HIF-1在乏氧适应性反应中是一个重要的中介调节因子，在结构上HIF-1存在有两个亚基HIF-1，但在这两个亚基中α活性较强。HIF-1α不仅与肿瘤细胞血管生成、能量代谢、侵袭以及转移有关，还与放、化疗的敏感性密切相关。放射治疗时，周边部的肿瘤细胞对辐射敏感而能够迅速被杀死，但中心部的乏氧细胞却有较高的辐射抗性，不易被杀死。因此氧效应在肿瘤放射治疗中有着重要意义。自噬具有维持细胞自我稳态，是一种细胞防护促生存的机制，然而过度自噬是一种促进细胞死亡的机制，即称为自噬性细胞死亡（autophagic celldeath，简称自噬），又称为II型程序性细胞死亡。细胞自噬是一种保守的过程，通过清除体内受损的细胞器，降解变性的大分子从而维持蛋白代谢平衡、细胞自我稳态、促进细胞生长发育，而在细胞无法继续维持自身生存时诱导细胞主动性死亡。本研究以HIF-1α为靶点，探讨HIF-1α在辐射诱导乳腺癌细胞自噬中的作用。目的探讨乏氧诱导因子1α (HIF-1α)在辐射诱导人乳腺癌MCF-7细胞自噬中的作用，并探讨HIF-1α在人乳腺癌MCF-7细胞放射治疗过程中的作用。方法(1)将人乳腺癌MCF-7细胞分为对照组（常氧组）、照射组（8Gy）、乏氧组、乏氧加照射组。(2)150μmol/L CoC12处理细胞模拟乏氧条件。(3)构建人靶向HIF-1α基因的shRNA寡核苷酸反转录病毒载体，磷酸钙转染的方法建立稳定转染的MCF-7HIF-1α Ri沉默细胞模型。(4)MDC及Hoechst染色方法分别用于检测细胞自噬和凋亡变化情况。(5)克隆形成方法检测细胞辐射敏感性。(6)Western blot方法检测HIF-1α及MAPLC3、AKT、PARP、p70、mTOR蛋白表达。结果1乏氧能够诱导HIF-1α表达和自噬发生Western blot检测HIF-1α及MAPLC3表达，MCF7细胞中假照组和照射组（8Gy）均未检测到HIF-1α的表达。在乏氧条件下，MCF-7细胞中HIF-1α表达增高，乏氧加照射后，HIF-1α的表达进一步升高。对照组、照射组、乏氧组和乏氧加照射组HIF-1α表达值分别为0、0、1、1.89，MAP LC3II/LC3I值分别是1.15、1.73、2.38和3.60。应用MDC染色检测MCF-7细胞自噬的变化。对照组细胞自噬阳性细胞占7%，照射组和乏氧组自噬阳性细胞分别升高为15%和18%（t=-9.695和-11.676，P<0.05），乏氧加照射组自噬阳性细胞进一步增高为23%（t=-14.930，P<0.05）。提示乏氧可以诱导MCF-7细胞HIF-1α表达，乏氧和电离辐射分别诱导自噬的发生，而乏氧加照射进一步的促进HIF-1α的表达和提高自噬水平。2MCF7HIF-1α Ri细胞模型的建立根据GenBank中人HIF-1α cDNA序列，利用生物信息学工具设计并合成，针对HIF-1α基因的特异性的寡核苷酸发夹环序列，并引入两个酶切位点（BglII和HindIII），经过退火和磷酸化与线性化的pSUPER载体连接构建pSUPER-HIF-1α RNAi表达载体，同时构建对照空载体。建立HIF-1α基因沉默细胞模型MCF-7HIF-1α Ri和对照模型MCF-7-pSUPER，用CoC12预处理48h后提取总蛋白检测HIF-1α蛋白表达，发现MCF-7-pSUPER组HIF-1α蛋白表达明显，MCF-7-pSUPER-HIF-1α Ri组HIF-1α表达明显降低。在MCF-7-pSUPER细胞中，8Gy照射后48h未检测到HIF-1α蛋白表达，乏氧组、乏氧加照射组均诱导HIF-1α蛋白表达，且乏氧加照射表达量明显高。而在MCF-7-pSUPER-HIF-1αRi中乏氧、乏氧加照射仅诱导HIF-1α蛋白微弱表达。以上结果表明，HIF-1α基因沉默的细胞模型MCF-7-pSUPER-HIF-1αRi构建成功，且在MCF-7-pSUPER-HIF-1αRi细胞中可有效抑制乏氧诱导HIF-1α表达。3HIF-1α促进乏氧条件下电离辐射诱导的人乳腺癌MCF-7细胞自噬为了初步分析HIF-1α是否参与乏氧和电离辐射诱导的MCF-7细胞自噬，将HIF-1α沉默后检测了乏氧和辐射诱导的MCF-7细胞自噬。首先，采用MDC染色检测自噬的变化。在MCF-7-pSUPER和MCF-7-pSUPER-HIF-1α Ri细胞模型中，假照组、照射组、乏氧组、乏氧加照射组自噬细胞阳性率分别为6%、6%、14%、11%和17.5%、12.5%、20%、15%（*P<0.05）。提示沉默HIF-1α抑制乏氧和电离辐射诱导的MCF-7细胞自噬。为进一步确定HIF-1α与自噬的调控关系，采用western blot实验检测自噬相关蛋白MAPLC3的表达。在MCF-7-pSUPER细胞模型中，假照组、照射组、乏氧组、乏氧加照射组LC3II/GAPDH的值依次为1、1.5、2.2、2.3，乏氧和照射明显增加MCF-7-pSUPER细胞自噬；而MCF-7-HIF-1αRi细胞模型中假照组、照射组、乏氧组、乏氧加照射组LC3II/GAPDH值依次为0.84、0.92、0.82、1.1。沉默HIF-1α表达后，与相同处理的MCF-7-pSUPER细胞相比，自噬均降低。提示沉默HIF-1α抑制乏氧和电离辐射诱导MCF-7细胞的自噬，即HIF-1α能够促进乏氧和电离辐射诱导的MCF-7细胞自噬。4沉默HIF-1α增加人乳腺癌MCF-7细胞在乏氧条件下的辐射敏感性用集落形成实验检测细胞存活分数的变化。与常氧组相比，MCF-7-pSUPER乏氧组细胞照射后（2、4、6和8Gy）存活分数升高（p<0.05），提示乏氧降低细胞辐射敏感性。与常氧组相比，MCF-7HIF-1α Ri乏氧组细胞照射后存活分数无显著性改变（p>0.05），即沉默HIF-1α后乏氧不改变MCF7细胞的辐射敏感性。结果表明， HIF-1α增加人乳腺癌MCF-7细胞在乏氧条件下的辐射抗性。5抑制自噬增加乳腺癌MCF-7细胞乏氧条件下的辐射敏感性应用3MA抑制细胞自噬，集落形成实验检测细胞存活分数，分析细胞辐射敏感性。与常氧组相比，常氧+3MA组照射后存活分数降低(p<0.05)，辐射敏感性增加。而乏氧组细胞照射后存活分数升高(p<0.05)，辐射敏感性降低。乏氧+3MA组细胞存活分数比乏氧组降低(p<0.05)，辐射敏感性较乏氧组升高，但仍低于常氧组(p<0.05)。即细胞辐射敏感性顺次降低（常氧+3MA组>常氧组>乏氧+3MA组>乏氧组）。提示MCF-7细胞在乏氧条件下辐射抗性的增加，乏氧诱导HIF-1α表达而激活MCF-7细胞自噬发挥一定作用。6HIF-1α在电离辐射诱导人乳腺癌细胞自噬中的作用机制采用western blot实验检测AKT、mTOR、p70蛋白表达， MCF-7-pSUPER细胞假照组、照射组、乏氧组、乏氧加照射组和MCF-7-HIF-1αRi细胞对照组、照射组、乏氧组、乏氧加照射组AKT/GAPDH值依次为1、0.61、0.55、0.41和1.1、1.21、0.76、1.38；mTOR/GAPDH值依次为1、0.7、0.51、0.2和0.85、0.79、0.88、0.93；p70/GAPDH值依次为1、0.5、0.3、0.2和0.86、0.62、0.8、0.62。可见，MCF-7-pSUPER细胞中，与假照组相比，照射组、乏氧组、乏氧加照射组AKT、mTOR、p70表达水平均降低，且乏氧加照射组降低更明显。沉默HIF-1α表达后，与MCF-7-pSUPER细胞相比，照射组、乏氧组、乏氧加照射组的AKT、mTOR、p70表达水平增加。以上结果提示，HIF-1α在乏氧条件下促进电离辐射诱导的自噬，其机制可能涉及AKT/mTOR通路。7HIF-1α不影响乏氧和电离辐射诱导的MCF-7细胞凋亡通过PI染色检测细胞凋亡，与对照组相比，MCF-7-pSUPER照射组、乏氧组、乏氧加照射组凋亡均增加；同样在MCF-7-pSUPER-HIF-1αRi细胞中，照射组、乏氧组、乏氧加照射组与对照组相比凋亡均增加。但MCF-7-HIF-1αRi与MCF-7-pSUPER相比较，相同处理组之间凋亡无明显改变。采用western blot实验检测凋亡相关蛋白PARP的表达，在MCF-7-pSUPER细胞中，假照组、照射组、乏氧组、乏氧加照射组cleaved PARP/PARP值依次为1、2.07、1.07、0.89；在MCF-7-HIF-1α Ri细胞中，假照组、照射组、乏氧组、乏氧加照射组cleaved PARP/PARP值依次为0.84、1.97、0.76、0.86。可见MCF-7-pSUPER和MCF-7-HIF-1αRi细胞相同处理组的cleaved PARP/PARP比值无明显差别。提示HIF-1α不影响乏氧和电离辐射诱导的MCF-7细胞凋亡。结论1.乏氧诱导人乳腺癌MCF-7细胞HIF-1α的表达和自噬发生；2.沉默HIF-1α增加人乳腺癌MCF-7细胞在乏氧条件下的辐射敏感性；3. MCF-7细胞在乏氧条件下辐射抗性增加，至少部分是因HIF-1α表达并激活MCF-7细胞自噬而发挥作用的。4.在人乳腺癌MCF-7细胞中，HIF-1α在乏氧条件下促进电离辐射诱导的自噬，其机制可能涉及AKT/mTOR通路。5. HIF-1α不影响乏氧和电离辐射诱导的MCF-7细胞凋亡；