创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）是世界范围内造成死亡和残疾的重要原因,且发病率正在急剧上升。然而目前尚无针对创伤性脑损伤的有效治疗方法。造成脑创伤的原发性损伤可导致急性细胞死亡,该过程很难干预。由原发性损伤诱导的继发性损害,涉及众多的细胞和分子机制,例如炎症、胶质细胞活化、氧化应激、细胞代谢、凋亡、以及自噬和线粒体自噬等,可为医疗干预和靶向治疗创造机会。Sirt1是去乙酰化酶家族中被研究最多的成员。去乙酰化酶家族是一组酵母沉默信息调节子2（SIRT2）的同源蛋白。这类酶可发挥赖氨酸去乙酰化作用,并与细胞能量代谢过程的中间产物相关,即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）。因此,sirtuins的活性可依赖于NAD+,并受其调节。而大量的研究表明,一些物质如白藜芦醇（Resveratrol,Res）等,可通过调节Sirt1的表达或活性来发挥重要作用。它在细胞生存、代谢、炎症等诸多方面中发挥重要作用。随着对Sirt1的进一步研究,人们发现Sirt1在神经退行性疾病中能发挥神经保护作用,且Sirt1活性与神经保护、自噬等相关。自噬是进化过程中高度保守的细胞内机制,在应激或营养缺乏状态下通过自分解代谢过程保存和再循环细胞器,对于维持细胞稳定,清除细胞内异常蛋白或细胞器方面发挥重要作用。自噬激活后,细胞质的异常蛋白或细胞器被隔离膜包裹形成自噬体,自噬体与溶酶体融合形成自溶酶体,异常胞浆蛋白或细胞器随后被溶酶体酶降解。在众多自噬相关蛋白（ATG）介导自噬的激活中,微管相关蛋白轻链3（LC3）被广泛用作自噬体检测的关键标记物。LC3主要以未加工的形式合成,即pro LC3。自噬激活后,pro LC3被ATG4裂解形成LC3-Ⅰ,LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺（PE）结合形成脂化LC3（LC3-Ⅱ）。转接蛋白p62促进泛素化蛋白结合至自噬体,并被自溶酶体降解。因此,p62表达的降低提示自噬流的发生。在大多数细胞中受损或功能失调的线粒体产生的ROS会通过线粒体自噬得到清除。受损线粒体膜电位丧失引起PTEN诱导的假定激酶1（Pink1）在线粒体外膜上积累,Pink1在外膜上募集泛素连接酶parkin使其磷酸化并激活。活化的parkin将自噬转接蛋白p62募集到受损线粒体,导致受损线粒体被自噬小体上的LC3包裹,受损或功能失调的线粒体随后在溶酶体中被降解。近年来有研究发现,Sirt1与自噬和线粒体自噬相关,然而在Sirt1参与的对创伤性脑损伤的神经保护作用中,是否通过自噬和线粒体自噬在严重脑创伤中发挥作用仍不清楚,本课题就严重脑创伤中Sirt1影响自噬和线粒体自噬的作用机制进行探讨,为严重脑创伤的治疗提供依据。研究方法:建立重物下落严重脑创伤小鼠动物模型,在创伤后不同时间点留取组织。侧脑室给药白藜芦醇,腹腔注射给予线粒体分裂抑制剂mdivi-1以及雷帕霉素进行干预,以假手术组和侧脑室给药DMSO溶剂组作为对照。利用Western blot检测Sirt1,LC3,P62的经时表达,以及给药各组的LC3,P62,PINK的表达,利用免疫荧光双重染色检测LC3在神经元中的表达。采取Rotarod动物行为学实验,检测不同给药组动物的运动协调能力。实验数据以均数±标准误（mean±SD）表示。应用Graph Pad prism6软件进行统计分析处理结果数据,多组间采用单因素方差分析,P<0.05被认为有统计学意义。结果:Western blot结果显示严重脑损伤后,损伤皮层及周围组织Sirt1表达随时间延长下降,1h开始下降明显,之后一直处于低表达状态,仅在24小时略有回升;损伤皮层下组织Sirt1表达在损伤后0.5小时开始明显下降,至损伤后3小时至最低,在损伤后3天略有恢复,后一直持续低表达水平至14天。损伤皮层及周围区域LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的相对表达在0.5小时有明显升高,之后回落明显,12小时又开始升高一直持续至损伤后3天,之后逐渐回落至假手术组水平一直持续至14天;损伤皮层下组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达在损伤后0.5小时亦明显上升,而后明显回落至假手术组水平,12小时开始又明显上升,24小时达高峰,损伤后3天逐渐降低至假手术水平并一直持续至14天。自噬连接蛋白p62在损伤皮层及周边部位表达随时间逐渐下降,在1小时明显降低,至3小时达最低点,12小时升高,24小时恢复至假手术水平,3天至7天又降低,14天恢复假手术水平;而损伤皮层下组织在0.5小时有明显减低,之后一直近似于假手术组,7天又略降低,14天恢复假手术组水平。动物行为学显示脑创伤后24小时动物运动协调能力明显减低,应用白藜芦醇预给药组动物的运动持续时间与假手术组无差异。白藜芦醇可发挥重要的改善神经功能,尤其是运动协调能力的作用。Western blot结果显示,预给药白藜芦醇损伤组可逆转损伤造成的LC3-Ⅱ的升高,恢复p62的表达,白藜芦醇可以阻止过度自噬的发生。荧光双标LC3B和Neu N显示神经元自噬在假手术组有一定存在,但损伤后在损伤周边LC3表达明显增高,尤其是神经元的自噬。而给药白藜芦醇组LC3在神经元的表达较单纯损伤组明显减少。定位于神经元的自噬也显著下降。Western blot结果显示,线粒体自噬关键蛋白PINK在严重脑创伤后下降明显,线粒体自噬明显受损,给药白藜芦醇可部分恢复PINK的表达。通过药物干预线粒体自噬发现,抑制线粒体分裂虽可部分恢复PINK的表达,但可阻断白藜芦醇对PINK的恢复作用。雷帕霉素激活线粒体自噬,但在本实验中,雷帕霉素没有明显改善损伤造成的PINK降低,且雷帕霉素不影响白藜芦醇恢复PINK的表达。由此我们发现通过mdivi-1抑制线粒体自噬会减弱白藜芦醇对PINK减低的恢复作用,而以雷帕霉素刺激线粒体自噬不影响白藜芦醇对创伤后PINK降低的恢复作用。同时我们发现给与mdivi-1抑制线粒体自噬可阻断白藜芦醇对LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达的抑制作用。这说明白藜芦醇缓解自噬不能与线粒体动力蛋白抑制剂发挥协同作用。而雷帕霉素不影响白藜芦醇对LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达的抑制作用。Western blot的结果显示白藜芦醇可以升高p62的表达,线粒体自噬抑制剂mdivi-1可协助白藜芦醇恢复p62表达至假手术水平。雷帕霉素不影响白藜芦醇对p62表达的升高作用。运动行为学结果显示在损伤后1天各给药组动物运动持续时间基本与假手术组一致,表明这几种药物单独或联合应用均可对脑创伤造成的运动能力减弱有恢复作用。结论:1.严重创伤性脑损伤损伤皮层及周围组织后自噬异常增高。2.白藜芦醇可改善脑创伤造成的运动协调能力下降。3.白藜芦醇可改善脑创伤诱导的自噬失调。4.上调Sirt1可以改善严重脑创伤造成的线粒体自噬功能受损。5.抑制线粒体分裂影响创伤后白藜芦醇对自噬和线粒体自噬的恢复。6.mTOR路径对白藜芦醇调控自噬和线粒体自噬无影响。